Il est essentiel de mettre au point des techniques pour étudier le transport des macromolécules entre le noyau et le cytoplasme, et d’identifier la mauvaise localisation des protéines suppressrices tumorales pour mieux comprendre la pathogénie de la LLC et aider au développement de nouvelles thérapies. Ce protocole fournit une méthode rapide et efficace pour produire des fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de cellules CLL primaires. Ces fractions peuvent être utilisées dans des expériences en aval, y compris les analyses d’activité enzymatique, l’analyse protéomique et le ballonnement occidental.
Cette technique élargira notre compréhension de la façon dont les thérapies et les signaux micro-environnementaux dans les tumeurs modifient le shuttling des protéines entre le noyau et le cytoplasme dans les cellules de CLL et potentiellement d’autres malignités de cellules B. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’emplacement des protéines et/ou attirer le mouvement des protéines, le cas échéant. Effectuez un gradient de détergent sur chaque lignée cellulaire que vous prévoyez utiliser pour assurer la génération optimale de fractions nucléaires et cytoplasmiques hautement enrichies.
Aux côtés de Jodie Hay et Michael Moles, jennifer Cassels, technicienne de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Obtenir des échantillons de sang périphériques auprès de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique précédemment consentie dans des tubes de collecte de sang EDTA, accompagnés du nombre de globules blancs. Les échantillons de sang humains doivent être considérés comme dangereux car ils contiennent potentiellement des virus transmissibles par le sang.
Veuillez vous assurer que ces échantillons sont manipulés dans une armoire de biosécurité de classe deux et que l’utilisateur porte un manteau de laboratoire et des gants en tout temps. Éliminer les matières contaminées par le sang dans les désinfectants. Si le nombre de globules blancs est égal ou supérieur à 40 millions de cellules par millilitre, diluer l’échantillon à un rapport d’un pour un avec rt CLL tampon de lavage.
Puis aliquot RT gradient de densité moyenne dans un tube de centrifugeuse conique de taille appropriée pour l’échantillon. Superposer délicatement l’échantillon sur le dessus du milieu et la centrifugeuse à 400 x g pendant 30 minutes à RT. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, récoltez doucement la couche blanche de cellules mononucléaires qui se sont accumulées à l’interface du milieu de gradient de densité dans le tampon de lavage CLL. Transférer ce monocouche isolé dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres frais.
Pour laver les cellules, ajouter 40 millilitres de tampon de lavage CLL à cette monomeuse et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le supernatant, feuilletez le fond du tube pour suspendre à nouveau la pastille, et répétez ce lavage. Jetez le supernatant, feuilletez à nouveau le fond du tube, puis suspendez la pastille cellulaire dans un volume défini de tampon de lavage CLL selon la taille de la pastille.
Après avoir compté les cellules et après la cytométrie d’écoulement pour vérifier la pureté cellulaire, placez les cellules dans des plaques de culture tissulaire à la densité cellulaire requise prête pour la stimulation ou le traitement médicamenteux. Après la stimulation et/ou le traitement médicamenteux, l’incubation est terminée. Transférer les cellules dans des tubes de microfuge et des granulés de 1,5 millilitre étiquetés individuellement en centrifugant à 200 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir jeté le supernatant, suspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS glacé avec des inhibiteurs de phosphatase. Centrifugeuse à 200 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnatant et gardez ces granulés d’extrait de cellules entières sur la glace pour d’autres préparations.
Pour préparer les fractions cytoplasmiques, suspendez doucement les granulés cellulaires dans 50 microlitres de tampon hypertonique 1x. Pour permettre aux cellules de gonfler, incubez-les sur la glace pendant 15 minutes. Après avoir effectué un gradient détergent pour déterminer la concentration optimale de détergent à utiliser pour un type de cellule spécifique, ajouter 0,8 à 2,5 microlitres de détergent dans chaque échantillon et vortex sur le réglage le plus élevé pendant 10 secondes.
Pour vérifier la lyse cellulaire, observez les cellules sous un microscope à contraste de phase avant et après l’ajout de détergent. Toutes les cellules ont un noyau dense et sombre entouré par le cytoplasme qui apparaît comme un halo lumineux. Une fois lysés, centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius.
Soigneusement, sans déranger la pastille, transférer le supernatant dans un tube de microfuge étiqueté pré-réfrigéré et conserver cette fraction cytoplasmique à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Assurer l’élimination complète de la fraction cytoplasmique pour éviter la contamination de la fraction nucléaire. À la pastille restante, qui contient la fraction nucléaire, ajouter 50 microlitres de tampon de lyse complète et re-suspendre par pipetting de haut en bas.
Pour solubiliser les protéines associées à la membrane nucléaire, ajouter 2,5 microlitres de détergent, vortex sur le réglage le plus élevé pendant 10 secondes, et incuber sur la glace pendant 30 minutes. Vortex sur le réglage le plus élevé pendant 30 secondes et centrifugeuse. Ensuite, transférez le supernatant dans un tube de microfuge étiqueté pré-réfrigéré et conservez cette fraction nucléaire à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie.
Pour les lysates de cellules entières, suspendre à nouveau les granulés d’extrait de cellules entières dans 100 microlitres de tampon de lyse complète par pipetting de haut en bas. Pour assurer une lyse cellulaire complète, ajouter cinq microlitres de détergent et incuber sur la glace pendant 30 minutes. Vortex sur le réglage le plus élevé pendant 30 secondes, puis centrifugeuse à 14 000 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
Transférer le supernatant dans un tube de microfuge pré-réfrigéré et conserver toute cette cellule lysate à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Pour quantifier le trafic de protéines entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques, effectuez une analyse quantitative des taches occidentales et importez les images. Pour afficher l’image dans le ruban image, cliquez sur le bouton Choisir dans le groupe Display et cliquez sur Chemi Channel.
Le dialogue Choose Display s’ouvrira pour permettre d’autres ajustements si nécessaire. Implémentez des améliorations supplémentaires à l’aide des curseurs réglables sur l’onglet de l’image LUT, y compris la luminosité ou le contraste. Utilisez l’onglet Courbes pour des réglages plus fins.
Pour l’analyse des données, cliquez d’abord sur le ruban Analyse. Pour analyser un seul canal, désélectionner les canaux qui ne sont pas analysés en cliquant sur la vignette Don’t Show Channel d’un canal, ne laissant que le canal désiré affiché. Pour quantifier l’intensité du signal, cliquez sur Ajouter rectangle pour ajouter des rectangles à l’image.
Cliquez sur le centre d’une entité telle qu’une bande protéique pour placer un rectangle autour d’elle. Après avoir ajouté les formes désirées, cliquez sur Sélectionnez pour retourner le curseur à l’outil de sélection. Pour soustraire le bruit de fond, cliquez sur le premier bouton du groupe Arrière-plan et sélectionnez Médiane dans le menu dropdown.
Réglez la largeur de la bordure à trois dans le dialogue d’arrière-plan et sélectionnez les segments qui représentent le mieux l’arrière-plan de l’image à utiliser pour le calcul d’arrière-plan. Pour exporter les données, cliquez sur l’onglet Formes au-dessus de la table. Pour la densitométrie, des valeurs dans la colonne Signal sont requises.
Le signal est la somme des valeurs d’intensité pixel ou total pour une forme moins le produit de l’arrière-plan dans la zone. Cliquez ensuite sur le bouton Rapport, cliquez sur Enregistrer comme ou lancer la feuille de calcul. Pour calculer l’expression normalisée de la protéine d’intérêt pour chaque plan ou variable dans la feuille de calcul enregistrée, divisez le signal obtenu pour la protéine d’intérêt par le signal de la bande de contrôle de chargement des protéines correspondante.
Pour exporter l’image, cliquez sur l’onglet Images trouvé au-dessus de la table, puis cliquez sur l’image à exporter. Si vous utilisez l’image pour une présentation de diapositives ou d’autres formats numériques, cliquez sur l’icône logicielle, passez au-dessus d’Export, cliquez sur Image pour les médias numériques, puis enregistrez l’image au besoin. L’enrichissement des cellules CLL avec un COE supérieur à 40 millions par millilitre à l’aide de centrifugation de densité permet une récupération cellulaire élevée.
L’analyse de l’échantillon par cytométrie d’écoulement après avoir pâlifié sur FSC et SSC révèlent la pureté des cellules CLL sont plus de 95%, comme indiqué par l’expression à double surface des marqueurs cellulaires CLL, CD19 et CD5. Quand des taches immuno ont été exécutées sur les fractions qui en résultent de la lignée cellulaire de CLL, Mac-1, et des cellules primaires de CLL, la fractionnement a indiqué que le niveau optimal de détergent pour des cellules de Mac-1 était à une à 60 dilution, comparée à un à 30 pour des cellules primaires de CLL. Quand la localisation subcellulaire de FOXO1 dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques a été déterminée dans Mac-1 et les cellules primaires de CLL, la génération des fractions fortement enrichies a été montrée par l’expression presque exclusive de lamin dans la tubuline nucléaire et bêta dans les fractions cytoplasmiques.
L’expression foxo1 a été réduite dans le cytoplasme suivant le traitement avec AZD 8055, comparé à NDC, accompagné d’une augmentation de l’expression foxo1 dans le compartiment nucléaire, démontrant ainsi la translocation de protéine. Après que les taches immunos individuelles de cinq échantillons primaires de CLL aient été quantifiées dans les fractions subcellulaires, AZD 8055 s’est trouvé pour réduire les niveaux d’expression de FOXO1 dans le cytoplasme et augmenter l’expression dans le noyau. BCR cross-linking augmentation de l’expression cytoplasmique FOXO1.
N’oubliez pas de garder tous les reagents et échantillons sur la glace pour prévenir la dégradation des protéines. Les fractions subcellulaires générées dans cette procédure peuvent également être utilisées dans des analyses d’activité enzymatique comme un test d’activité FOXO, qui permet de faire des parallèles entre l’emplacement cellulaire de FOXO1 et son activité de liaison de l’ADN. Le développement de cette technique nous a permis de lutter contre le trafic de protéines spécifiques dans les cellules CLL en réponse à des inhibiteurs sélectifs et soutient nos études parallèles d’immunofluorescence pour générer un ensemble de données robustes et quantifiables.
