Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche en neurosciences sur la façon dont le transport du substrat de transduction du signal et un dégagement des déchets se produisent dans les espaces extracellulaires du cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’échantillonnage et la quantification de grandes molécules extracellulaires dans le fluide interstitiel ou ISF d’animaux éveillés en mouvement libre. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils, retirez les cheveux du crâne d’une souris anesthésiée et utilisez les barres d’oreille et une pince nasale pour fixer solidement l’animal fixe sur un adaptateur.
Appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et placez l’adaptateur sur l’appareil stéréotaxique. Utilisez un scalpel pour faire une incision cutanée sagittally sur le crâne et attacher une perceuse sur le manipulateur du cadre stéréotaxique. Abaissez la perceuse jusqu’à ce qu’elle touche doucement lambda et réinitialise la coordonnée DV de la perceuse à zéro.
Ensuite, déplacez la perceuse à bregma pour réinitialiser les coordonnées AP et ML à zéro. Déplacez la perceuse de bregma à la coordonnée verticale. Abaissez la perceuse au crâne et réglez la coordonnée DV à zéro à nouveau.
Après avoir répété la procédure pour une troisième coordonnée, percer soigneusement un trou de bavure à la coordonnée cible, suivi d’un deuxième trou sur le côté contralatéral de l’os pariétal. Insérez une vis osseuse dans le deuxième trou et placez le morceau de verrouillage à partir d’un couvercle de tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre sur le crâne de sorte que les trous de bavure sont dans le cercle. Ensuite, placez une canule guide sur le bras plus court de l’adaptateur stéréotaxique et attachez la canule avec un écrou de bouchon.
Réglez le bras plus long de l’adaptateur stéréotaxique sur la pince d’électrode et fixez le bras sur le manipulateur de l’appareil stéréotaxique. Faites pivoter l’assemblage stéréotaxique DV sur le bras manipulateur de 12 degrés et déplacez la canule du guide vers le trou de bavure. Ensuite, abaissez lentement la canule guide de 1,2 millimètre dans le cerveau.
Ajouter du ciment dentaire à la couronne jusqu’à ce que la partie métallique de la canule guide, la vis osseuse et tout crâne exposé soient couverts et fixés et permettent au ciment de sécher. Après 12 à 20 minutes, retirez l’adaptateur stéréotaxique de la pince à électrode, retirez l’écrou du bouchon et remplacez l’adaptateur stéréotaxique par une sonde factice. Ensuite, refasten l’écrou bouchon, libérer la souris de l’appareil stéréotaxique, et abriter la souris seule dans une cage individuelle.
Avant de mettre en place la microdialyse, remplissez une seringue jetable d’un millilitre d’eau distillée et utilisez un tube viton pour connecter la seringue à la sortie d’une sonde de microdialyse. Couvrez manuellement les trous d’évent et déprimez doucement le piston de seringue pour infuser la sonde avec de l’eau. Confirmer que de l’eau apparaît dans l’entrée de la sonde et qu’il y a une fuite à la surface de la membrane de microdialyse.
Pour activer la sonde, submergez les membranes de la sonde dans 70-100% éthanol pendant deux secondes, suivie d’une deuxième infusion d’eau distillée. Fixez une aiguille de raccordement à une entrée et une ligne de sortie et chargez une seringue jetable de trois millilitres avec tampon de perfusion fraîchement préparé. Connectez une seringue munie d’une aiguille émoussée à l’extrémité de l’entrée du tube et utilisez une pompe à seringues pour remplir l’ensemble du tube d’un tampon de perfusion.
Lorsque le tube est plein, remplacez l’aiguille de raccordement entre les lignes d’entrée et de sortie par la sonde de microdialyse activée et l’écrou de bouchon et montez un tube à rouleaux dans le tube de sortie sur une pompe à rouleaux. Démarrez la pompe à seringues à 10 microlitres par minute et la pompe à rouleaux à 9,5-9,8 microlitres par minute. Placez maintenant le collier autour du cou de l’animal implanté anesthésié de canule de guide et enlevez l’écrou de chapeau et la sonde factice.
Insérez lentement la sonde de microdialyse à travers la canule guide et attachez l’écrou du bouchon. Ensuite, placez la souris dans une cage reliée à un système en mouvement libre et attachez la souris avec le collier. Après au moins une heure, arrêter séquentiellement la pompe à rouleaux et la pompe à seringues, redémarrer les pompes avec la pompe à seringue réglée à 20% plus vite que la pompe à rouleaux et placer l’extrémité libre du tube de sortie sur un collecteur de fraction réfrigéré pour recueillir le cerveau ISF.
Lorsque le volume expérimental approprié a été obtenu, retirez la sonde et manipulez la récupération de la souris comme nous venons de le démontrer. Conformément aux observations précédentes, lorsque 50 picrotoxines micromolaires sont administrées par microdialyse inverse comme l’ont démontré les souris éveillées C57B6J, une augmentation des niveaux interstitiels de tau endogène est observée par rapport aux niveaux mesurés chez les animaux traités avec un contrôle du véhicule. En plus des administrations pharmaceutiques, la microdialyse peut être combinée avec d’autres méthodes in vivo comme l’enregistrement EEG ou l’optogénétique pour répondre à d’autres questions sur la façon dont l’activité neuronale influence la concentration du substrat dans l’ISF.
