Ce protocole démontre une méthode améliorée pour l’obtention de cellules épithéliales dentaires humaines. Il est difficile d’identifier la pastille de cellule agrégée pendant les procédures. Soyez prudent lorsque vous manipulez un surnageant pour éviter la perte de populations de cellules.
Pour commencer, récoltez les follicules dentaires lors de l’extraction chirurgicale des troisièmes molaires touchées. Commencez les procédures d’isolement cellulaire ou stockez les follicules dentaires à quatre degrés Celsius dans le DPBS avec 3% de pénicilline-streptomycine. Pour laver les follicules dentaires, tenez le follicule dentaire avec une pince à épiler et placez-le dans le tube de lavage 1.
Secouez-le doucement 10 à 15 fois. Sortez-le et placez-le dans le tube 2. Encore une fois, secouez-le 10 à 15 fois.
Enfin, sortez-le et placez-le dans le tube 3, puis secouez-le. Après avoir lavé trois fois, placez le follicule dentaire dans un plat de culture de 60 millimètres. Hachez le tissu avec des ciseaux à tissu jusqu’à ce que le follicule dentaire ait un aspect pulpeux ou squishy.
Utilisez une petite section latérale du plat de culture pour minimiser la perte de tissu. Mélanger un millilitre de collagénase de type 1 et une solution de protéase dans un tube conique de 15 millilitres. Transférer le tissu haché dans le tube conique de 15 millilitres, puis le secouer doucement et l’incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Ajouter cinq millilitres de 0,05 % de trypsine-EDTA au tube. Agitez-le et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Préparer un milieu kératinocyte contenant un milieu sans sérum kératinocyte et 10% de sérum bovin fœtal.
Ajouter trois millilitres de milieu kératinocytes dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Placez une passoire de 40 micromètres sur le dessus de ce tube. Ensuite, aspirez le surnageant du tube contenant le tissu avec une pipette sérologique de 10 millilitres et passez-le à travers la passoire.
Transférer la suspension collectée dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube et retirez le surnageant. Ajoutez ensuite trois millilitres de milieu sans sérum kératinocyte.
Centrifuger pendant encore trois minutes et retirer le surnageant. Plaquer la population unicellulaire dans une boîte de culture de 60 millimètres en utilisant le milieu sans sérum kératinocyte. Maintenir le plat de culture avec un volume final de cinq millilitres dans une atmosphère humidifiée de 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.
Les cellules à morphologie épithéliale sont apparues dans les sept à 10 jours suivant le placage des populations unicellulaires. Le nombre de cellules épithéliales en forme de pavé variait de un à 10 au moment de l’émergence et les cellules se sont étendues en colonies au fil du temps. L’étape la plus cruciale consiste à réduire le follicule dentaire en petites particules.
Il améliore la séparation des cellules individuelles du tissu folliculaire. Les cellules mésenchymateuses peuvent être isolées du follicule dentaire humain. L’environnement de culture contenant du sérum sélectionne les cellules mésenchymateuses et inhibe la croissance épithéliale des populations unicellulaires.
Ce protocole fournit la méthode d’obtention des cellules épithéliales dentaires humaines. Les cellules épithéliales dérivées du follicule dentaire peuvent être utilisées pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires.
