Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines biotechnologiques et biomédicaux tels que la base moléculaire derrière les effets de Warburg et de Crabtree. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude à haut débit des effets de certaines substances dans le métabolisme respiratoire et fermentatif. Commencez par inoculer un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de cellules de levure froides et stériles d’extrait de levure peptone dextrose, ou bouillon YPD, avec 250 microlitres de cellules de levure S.cerevisiae conservés en glycérol à 20 degrés Celsius négatifs.
Incuber la levure pendant la nuit dans un shaker orbital à 30 degrés Celsius et 200 rpm. pour strier sur un plat petri rempli d’agar de 60 millilitres et de 2 %, le lendemain matin. Culture du plat à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies isolées soient observées.
Puis inoculer une seule colonie isolée dans un nouveau tube conique contenant 10 millilitres de bouillon frais et stérile de 2%YPD pour la culture nocturne à 30 degrés Celsius avec secousses. Pour la configuration de la courbe de croissance des microplaques, ajouter 145 microlitres d’un milieu culturel expérimental approprié à chaque puits d’une microplaque stérile de puits 10 par 10 avec couvercle et inoculer chaque puits avec cinq microlitres de la culture nocturne. Puis incuber la plaque multi-puits dans un lecteur de microplaque à 30 degrés Celsius avec agitation constante à 200 rpm pendant 48 heures, mesurant la densité optique à 600 nanomètres toutes les 30 ou 60 minutes.
Pour la configuration conique secouée de croissance-courbe de flacon, inoculer des flacons coniques de 20 millilitres contenant 4,8 millilitres d’un média de culture stérile approprié avec 200 microlitres de culture pré-inoculum à une densité optique de 600 nanomètres de deux pour l’incubation à 30 degrés Celsius et 250 rpm. L’agitation à 250 révolutions par minute est essentielle pour atteindre une croissance appropriée dans de faibles concentrations de sources de carbone qui exercent une croissance respiratoire que nous avons observé une croissance réduite de levure dans des conditions respiratoires à des vitesses d’agitation inférieures. Pour permettre la mesure de la densité optique à 600 nanomètres toutes les deux heures pendant 24 heures, diluer 100 microlitres de la culture de flacon conique secoué dans 900 microlitres d’eau distillée dans une cuvette spectrophotomètre d’un millilitre et mélanger délicatement par pipette.
Pour le traitement des données, dans un logiciel de paquet statistique approprié, créez un nouveau fichier de projet, ouvrez le nouveau menu de table et de graphique et sélectionnez XY. Sous le menu de données de l’échantillon, sélectionnez commencer par une table de données vide et un graphique de ligne de connexion. Laissez la section X non sélectionné dans les sous-comités pour les répétitions ou les valeurs d’erreur. Dans la section Y, sélectionnez entrez 10 valeurs de répétition dans des sous-comités côte à côte et tracez la moyenne et l’erreur SD. Cliquez ensuite créer.
Entrez l’heure à laquelle les mesures de la DO ont été obtenues dans la colonne X et les valeurs d’OD obtenues à partir des cultures de la colonne Y. Pour identifier la phase de croissance exponentielle transformant les données de la colonne Y en logarithmes, cliquez sur analyser et sélectionner l’analyse de transformation. Utilisez Y égale le journal Y pour sélectionner les valeurs Y et ouvrir la galerie de résultats.
Sélectionnez la table de données transformatrice, cliquez sur analyser et sélectionnez l’analyse de régression linéaire, à l’exclusion des valeurs de densité optique qui ne suivent pas une tendance linéaire en sélectionnant les valeurs de la table et en déprimant le contrôle et l’E.In la galerie de tableaux de données, sélectionnez les données d’une table et cliquez sur analyser. Sélectionnez l’analyse de l’ajustement de la courbe de régression non lignenelle et les ensembles de données à analyser, et cliquez sur OK. Appliquez ensuite les moindres carrés adaptés aux données, en laissant la section interpolate non sélectionné, et cliquez sur OK. Ensuite, ouvrez un nouveau fichier de projet, et dans le nouveau menu table et graphique, sélectionnez le choix de la colonne, commencez par une table de données vide et le graphique désiré. Définissez le graphique pour tracer la moyenne avec l’écart type, et cliquez sur créer.
Copiez les valeurs moyennes ou delta du temps à partir du tableau des résultats de l’ajustement non ligneux dans la galerie de résultats et coller les données dans une colonne. Enfin, cliquez sur analyser et sélectionner l’analyse de l’intérêt dans le menu des analyses de colonne pour comparer les paramètres cinétiques des différentes conditions nutrimentales. Les valeurs du seuil cinétique de croissance varient d’une force à l’autre et doivent être évaluées en fonction des conditions que nous utilisons dans l’analyse.
Les cultures démontrant un phénotype fermentatif ont une petite phase de décalage et une phase exponentielle avec un taux de croissance élevé. Les cultures qui obtiennent de l’énergie principalement par phosphorylation oxydative présentent une phase de décalage plus longue avec un taux de croissance lent pendant la phase exponentielle. Le calcul du taux de croissance spécifique et le doublement du temps des courbes de croissance à l’aide de l’équation de croissance exponentielle permettent d’établir des seuils pour les valeurs de croissance respiratoires et fermentatives.
Par exemple, dans ces expériences représentatives, les effets de différentes concentrations de resvératrol sur les cellules BY4742 de S.cerevisiae révèlent la modification du statut énergétique cellulaire en réponse aux concentrations variables de glucose. Ici, la supplémentation avec 10%glucose démontre que les concentrations inférieures d’ammonium favorisent le métabolisme fermentatif comme en témoigne une phase de croissance exponentielle prolongée dans ces cultures, tandis qu’une concentration plus élevée induit un métabolisme respiro-fermentatif comme en témoigne une phase de décalage prolongée et un taux de croissance plus lent pendant la phase exponentielle. Enfin, de fortes différences dans les valeurs fermentatives de doublement du temps peuvent être observées entre ces deux souches de levure différentes cultivées dans les mêmes conditions, soulignant la nécessité de valider le seuil de double temps pour chaque souche analysée.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que ce protocole n’est utilisé que pour dépister le phénotype. Les effets spécifiques sur la respiration et la fermentation doivent être confirmés par des analyses de consommation d’oxygène ou par l’accumulation de sous-produits de fermentation respectivement.
