Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la maladie d’Alzheimer, en particulier les premiers événements impliqués dans l’effondrement du cône de croissance. Le principal avantage de cette technique est de rendre possible la visualisation et l’analyse des cônes de croissance axonal immédiatement après le traitement bêta-amyloïde. Commencez par utiliser des micro-ciseaux pour émincer les cortices cérébrales fraîchement isolées des souris embryonnaires de jour-14 dans le milieu de culture des neurones sans antibiotiques.
Recueillir les tissus et centrifuger les tissus à 87G pendant trois minutes. Après centrifugation, retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de trypsine de 0,05% à la pastille. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et mélanger en tapant toutes les cinq minutes.
Après 15 minutes, ajouter quatre millilitres de moyenne A pour neutraliser la trypsine et mélanger en tapant. Puis centrifuger les tissus à 178 fois G pendant trois minutes. Après avoir enlevé le supernatant, ajouter la solution inhibiteur de la trypsine DNAse et du soja et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en mélangeant toutes les cinq minutes comme avant.
Lorsque le temps d’incubation est écoulé, ajouter quatre millilitres de A.Mix moyen et centrifugeuse comme avant. Après avoir enlevé le supernatant, ajouter quatre millilitres de moyenne A et triturer les tissus avec une pipette Pasteur polie jusqu’à ce qu’aucun débris n’est observé. Ensuite, filtrez les tissus triturés avec un maillage de la taille d’un pore de 70 microns.
Après filtration, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculez la densité cellulaire. Pipette 0,8 fois 10 à la quatrième cellule dans le milieu A dans chaque puits d’une diapositive de culture de huit puits. Puis incuber dans une atmosphère humidifiée de 10% de CO2 à 37 degrés Celsius.
Après quatre heures de culture, changer le milieu de la culture à moyen B.La pureté des neurones en utilisant cette méthode est d’environ 75%Commencez cet essai au moins une semaine à l’avance en ouvrant un flacon frais de pleine longueur commercialement obtenu bêta 42 et la dissolution du contenu dans stérile, l’eau distillée à une concentration de 0,5 millimolaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant sept jours pour induire l’agrégation et la toxicité. Préparer des aliquots de bêta A agrégée 1-42 et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation.
Au quatrième jour de la culture neuronale, traiter les puits avec 100 microlitres de 0,5 micromolaire agrégé A bêta 1-42 ou solution de véhicule dans le milieu B pendant une heure comme précédemment démontré. Après l’heure s’est écoulée, enlever le milieu de culture et de fixer immédiatement les neurones avec 4%paraformaldéhyde contenant 4% saccharose en PBS pendant une heure à 37 degrés Celsius sur une plaque chaude. La fixation est d’autant plus importante que le maintien de la forme des cônes de croissance est essentiel pour ce protocole.
Après la fixation, laver les neurones trois fois avec PBS. Puis après avoir enlevé la chambre, monter les neurones avec un milieu de montage aqueux. Séchez le milieu de montage à quatre degrés Celsius pendant deux à quatre jours.
Capturez toute la surface de chaque puits à l’aide d’une lentille objective sèche de 20 X sur un microscope inversé. La capture et l’analyse de toute la zone de chaque puits sont importantes pour éviter la subjectivité. Classez les plus longs neurites de chaque neurone au stade trois ou quatre comme axones.
Les cônes de croissance axonal manquant de lamellipodia ou possédant moins de trois filopodia sont considérés comme des cônes de croissance effondrés. Une bêta 1-42 oligomers, montré ici avant incubation, agrégé après sept jours d’incubation à 37 degrés Celsius. Après traitement avec l’agrégat A bêta 1-42, l’immunostaining avec un anticorps pour l’oligomer toxique d’une bêta montre la coloration positive en rouge sur A bêta 1-42 neurones traités, mais pas les neurones traités par véhicule.
Les premiers phénomènes induits par un traitement bêta 1-42 ont été analysés après quatre jours dans la culture. Les axones identifiés ont été confirmés en tant que tels par immunostaining positif pour le marqueur axonal tau-1 montré dans l’immunostaining rouge et négatif pour le marqueur dendritique, MAP-2, montré en vert. Après une heure de traitement du véhicule, les cônes de croissance avaient répandu lamellipodia et plusieurs filopodia.
Ceux-ci ont été identifiés comme cônes de croissance sains. Inversement, une heure de traitement bêta A 1-42 a conduit à des cônes de croissance rétrécis, qui n’ont développé aucune lamellipodia ou filopodia. Ceux-ci ont été identifiés comme cônes de croissance effondrés.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de fixer les cellules avec 4%PFA et 4% saccharose à 37 degrés Celsius à mon-nor-idge ce protocole de fixation dans le meilleur. Suivant ce protocole, d’autres méthodes comme l’imagerie à cellules vivantes et la transfection génétique peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions comme quand et comment les cônes de croissance de l’axon sont effondrés et comment les cônes de croissance effondrés sont récupérés.
