Les anticorps monoclonaux dérivés sont principalement utilisés dans les réactifs immunitaires thérapeutiques diagnostiques, ce qui souligne la nécessité de produire des anticorps stables et fiables en production limitée préparés. Les méthodes décrites ici ont prouvé que la production d’anticorps recombinants pouvait augmenter l’efficacité de la production d’anticorps monoclonaux et minimiser les coûts associés à la main-d’œuvre et au temps. Les méthodes sont utilisées pour développer l’aminopeptidase et les conjugués anticorps-médicament à base d’anticorps et d’autres produits thérapeutiques, ce qui aide à clarifier le rôle de l’APN dans la prévention et le traitement des infections bactériennes et virales.
La démonstration de la procédure sera Yan Li, un étudiant de troisième cycle de mon laboratoire. Pour commencer, injectez par voie intrapéritonéale 100 microgrammes de protéine APN dans les souris femelles adultes sélectionnées pour un regain d’antigène final. Après trois jours d’injection, prélever la rate des souris et laver avec DMEM deux fois pour éliminer le sang et les cellules graisseuses.
Filtrer la suspension de cellules de rate à l’aide d’une grille de cuivre de 200 mailles pour éliminer les débris tissulaires et récolter les cellules de la rate en utilisant la centrifugation pour enlever la membrane de la rate. Ensemencer les cellules myélomateuses SP20 de la souris dans une fiole de 25 centimètres carrés contenant cinq millilitres de DMEM complétée par 6% de sérum bovin fœtal et cultiver les cellules à 37 degrés Celsius et 6% de dioxyde de carbone dans une atmosphère pour maintenir la viabilité cellulaire. Après cinq à six jours de culture, les cellules devraient atteindre 80 à 90% de confluence après la réanimation et apparaître rondes, brillantes et claires au microscope.
Un jour avant l’hybridation, prélever des macrophages dans les cavités péritonéales des souris. Ensemencez les macrophages péritonéaux à une densité de 0,1 à 0,2 fois 10 à la cinquième par millilitre dans des plaques de 96 puits, contenant chacune 100 microlitres de milieu HAT et les incuber pendant la nuit. Pour l’hybridation, aspirez doucement les cellules SP20 avec une pipette de 8 à 10 bouteilles et suspendez-les dans 10 millilitres de milieu DMEM sans sérum.
Lavez les cellules avec du DMEM frais et centrifugez-les deux fois, puis remettez-les en suspension dans 10 millilitres de DMEM. Mélanger les cellules quantifiées de la rate avec des cellules SB20 dans un rapport de 10:1 et les transférer dans des tubes de 50 millilitres. Après centrifugation, jeter le surnageant et recueillir les pastilles au fond des tubes.
Tapotez le tube pour desserrer les granulés avant l’hybridation. À l’aide d’un compte-gouttes, ajoutez un millilitre de polyéthylèneglycol 1500 préchauffé à 37 degrés Celsius goutte à goutte à la pastille de cellule desserrée pendant 45 secondes tout en tournant doucement le fond du tube. Ensuite, ajoutez lentement un millilitre de DMEM préchauffé à 37 degrés Celsius au mélange pendant 90 secondes, suivi de 30 millilitres supplémentaires de DMEM frais et placez le tube de fusion dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Après l’incubation, récoltez les cellules. Resuspendre le milieu HAT et la culture dans une plaque de 96 puits inoculée avec des macrophages péritonéaux. Après cinq jours, ajoutez 100 microlitres de milieu HAT frais à chaque puits.
Et encore une fois après cinq jours d’incubation, remplacez le milieu par un milieu HAT. Utiliser une plaque de microtitrage recouverte de cinq microgrammes par millilitre de protéine APN diluée dans 0,05 molaire PBS pour analyser les anticorps monoclonaux dans le surnageant de l’hybridome à l’aide du test ELISA. Cultiver les anticorps pET28a plus les anticorps recombinants aminopeptidase NBL21 transformés bactéries en présence de bêta-d-1-thiogalactopyranoside millimolaire dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 10 heures.
Ensemencez 100 microlitres 0,5 fois 10 à la cinquième cellule ovarienne de hamster chinois par puits dans une plaque de 96 puits pour l’incubation à 37 degrés Celsius et une atmosphère de dioxyde de carbone à 6% pendant 18 à 24 heures. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, diluer les anticorps recombinants pIRES2-zs Green one aminopeptidase et plasmide avec Opti-MEM jusqu’à une concentration finale de 0,1 microgramme par microlitre. Après cinq minutes, mélanger les 50 microlitres de pIRES2-zs Green dilué un anticorps recombinant aminopeptidases et plasmide avec un microlitre de Lipofectamine 2000 et 49 microlitres d’Opti-MEM.
Après 20 minutes d’incubation, ajouter 100 microlitres du mélange à chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant des cellules CHO. Quatre à six heures après la transfection, remplacer le milieu par du DMEM F12 complété par 10%FBS. Après 48 heures d’incubation, ajoutez 400 microgrammes par microlitre G418 à chaque puits pour sélectionner les cellules transfectées de manière stable.
Après 10 jours de sélection à l’aide d’un milieu DMEM F12 complété par 10% FBS et 400 microgrammes par microlitre G418, triez les cellules avec un tri cellulaire activé par fluorescence. Diluer en série les cellules positives récoltées. Ensemencez-les en moyenne à 0,5 à 2 cellules par puits dans une plaque de 96 puits et cultivez-les dans un incubateur de dioxyde de carbone à 6% à 37 degrés Celsius.
Dans une analyse microscopique représentative, toutes les cellules d’hybridomes apparaissaient rondes, brillantes et claires. Les anticorps monoclonaux purifiés possédant des chaînes lourdes de 50 kilodaltons et légères de 25 kilodaltons ont été confirmés par SDS-PAGE et ont été trouvés dans l’ascite purifiée. Les titres de ces anticorps monoclonaux anti-APN dans les surnageants de culture et l’ascite sont présentés ici.
L’isotypage des anticorps monoclonaux de souris a révélé que les anticorps dérivés des clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 et 6C56 possédaient des sous-classes d’immunoglobuline G2B tandis que l’APN 2A20 était un anticorps de type immunoglobuline G2A kappa et que l’anticorps monoclonal APN 3FD9, 3F10 et 10F3 appartenait à l’immunoglobuline de type M et traitait les chaînes légères kappa. La plupart de ces anticorps monoclonaux présentaient des valeurs AV supérieures à 50%, ce qui indique qu’ils ciblaient différents épitopes dans l’APN, tandis que l’anticorps APN 5C51 reconnaissait des épitopes antigéniques comme ceux reconnus par les anticorps monoclonaux APN 3C48, 5B31 et 6C56. Le gène APN 5B36 VHVL amplifié a été ligaturé en un vecteur pET28a positif ou pIRES2-zs Green pour construire les plasmides d’expression recombinants pET28a positif RABS APN et pIRES2-zs Green un RABS APN respectivement.
Les anticorps exprimés par pET28a plus les anticorps recombinants aminopeptidase NBL21 et pIRES2-zs Green un anticorps recombinant aminopeptidase cellules NCHO ont été purifiés et analysés à l’aide de tests ELISA et IFA. Cependant, seul l’anticorps exprimé dans le surnageant des anticorps recombinants pIRES2-zs Green one aminopeptidase des cellules NCHO reconnaît la protéine APN. La liaison des anticorps monoclonaux APN 5B36 aux protéines APN a atteint un équilibre plus tôt que les anticorps recombinants.
La purification des anticorps monoclonaux dans le surnageant à l’aide de la protéine A agarose est meilleure que l’utilisation de la précipitation saturée de sulfate d’ammoniac.
