Les mitochondries sont essentielles à la santé neuronale. Dans de nombreuses maladies neurodégénératives, les mitochondries axonales sont les premières à en souffrir, mais on ne sait pas ce qui rend les mitochondries axonales si spéciales. Le gradient de pression fluidique dans les chambres utilisées dans ce protocole permet le traitement sélectif des axones mitochondriaux.
Cela laisse les processus du corps cellulaire intacts et nous permet de nous concentrer sur la biologie axonale. Nous montrons ici la dépolarisation des mitochondries avec un colorant sensible au potentiel membranaire, mais cette méthode peut être appliquée à de nombreux types de cellules neuronales et à des lectures fluorescentes. Pour commencer, placez les six plaques de puits codées dans une hotte stérile et lavez-les deux fois avec de l’eau distillée double stérile.
Laissez les plaques sécher en position inclinée pendant trois à cinq minutes. Éliminer l’excès d’eau par aspiration sous vide ou pipetage. Faites ensuite tremper la chambre microfluidique dans de l’éthanol à 80%.
Encore une fois, séchez la chambre microfluidique pendant trois à cinq minutes en position inclinée et retirez l’excès d’éthanol avec un embout de pipette. Lorsqu’il est complètement sec, placez la chambre microfluidique au centre du puits et de la plaque. Tapotez doucement la chambre microfluidique à ses bordures et la section microrainure au milieu pour une fixation appropriée à la plaque de verre.
Tout d’abord, collectez le nombre souhaité de neurones dissociés de l’hippocampe dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube à 1000 fois G pendant quatre minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans huit microlitres de milieu neurobasal B-27.
Distribuez ensuite la solution cellulaire dans l’entrée du canal de la chambre microfluidique. Tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement dans le canal. À l’aide d’une pipette, aspirer toute suspension cellulaire restante à la sortie du canal.
Incuber la chambre microfluidique avec des cellules pendant 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, remplissez le puits axonal supérieur avec 50 microlitres de milieu neurobasal B-27 et tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement. Remplissez chaque puits du côté soma avec 150 microlitres de milieu neurobasal B-27, créant une bulle de tension sur le dessus.
Remplissez également les deux puits du côté axonal avec 100 microlitres de milieu neurobasal B-27 chacun. Après sept à huit jours de culture in vitro, assurez-vous que les axones se sont développés à travers les microrainures et se sont étendus dans le compartiment axonal. Lavez l’appareil en retirant le milieu neurobasal B-27 et en ajoutant 100 microlitres de milieu d’imagerie préchauffé aux puits supérieurs des canaux axonal et soma.
Laissez le fluide s’écouler vers les puits inférieurs. Retirez le milieu des puits inférieurs et tout milieu restant des puits supérieurs, et répétez avec un milieu frais, en laissant les puits vides à la fin du lavage. Ajoutez ensuite 100 microlitres de dilution TMRE nanomolaire aux puits somatiques et axonaux.
Laissez le fluide s’écouler à travers les deux compartiments, jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans tous les puits. Faites le plein avec le milieu contenant TMRE. Sélectionnez une région d’intérêt dans le compartiment somatique et suivez-la à travers les microsillons dans le compartiment axonal.
S’assurer que les microrainures imagées dans les compartiments somatique et axonal sont adaptées les unes aux autres. Après avoir changé le nom du fichier, acquérir des images de fluorescence rouge en utilisant une excitation de 561 nanomètres et des longueurs d’onde d’émission de 625 nanomètres. Assurer une différence de volume entre les chambres soma et axonale en vérifiant la présence d’une bulle de tension du côté somatique.
Retirez ensuite le milieu d’imagerie des deux puits du côté axonal, à l’exception du milieu à l’intérieur du canal. Pour induire une dépolarisation mitochondriale, ajouter 160 microlitres de 20 micromolaires d’antimycine A diluée dans le milieu d’imagerie au puits axonal supérieur. Laissez-le s’écouler à travers le canal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans les deux puits axonaux.
Répétez l’imagerie, en veillant à ce que les mêmes positions soient imagées que lors de l’acquisition de la ligne de base, en identifiant les microrainures. En utilisant ce protocole, les neurones primaires de l’hippocampe ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques, suivis d’une coloration mitochondriale avec un colorant sensible à la membrane, TMRE. Une coloration homogène des mitochondries a été observée des deux côtés des microrainures, mais pas au milieu.
Lors de l’ajout d’antimycine A à la face axonale, les mitochondries somiques ont conservé le signal TMRE, tandis que la fluorescence a été perdue de l’axonal Mitochondries Assurez-vous qu’il ne reste pas d’humidité dans le puits ou sur l’appareil avant d’assembler l’appareil. Sinon, les chambres ne seront pas scellées. En utilisant cette méthode, nous pouvons étudier les effets de la perte de la fonction mitochondriale dans l’axone et les fonctions locales, ainsi que son influence sur la signalisation rétrograde et la survie cellulaire globale.
On a longtemps pensé que la biogenèse mitochondriale se produisait exclusivement dans le corps cellulaire. Cette méthode nous a permis de révéler que les dommages aux mitochondries axonales nécessitaient une traduction locale du court de la protéine PINK1.
