Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de micro-hémorragie cérébrale tels que l’étiologie, la distribution, et la détection de la micro-hémorragie cérébrale et ainsi de suite. Le principal avantage de cette technique est que les injections de LPS provoquent une inflammation. De plus, l’injection de LPS est assez simple, économique et rentable.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’induction cérébrale d’hémorragie, elle peut également être appliquée à d’autres désordres de cerveau tels que la dépression, la schizophrénie, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, et la maladie de prion. Administrer le LPS à une dose d’un milligramme par kilogramme de poids corporel aux rats sprague dawley mâles de 10 semaines par injection intrapénitale, puis retourner chaque rat dans la cage à la maison. Répétez l’injection de LPS après six heures et 16 heures.
Veuillez noter que l’injection de LPS aux rats SD à une dose d’un milligramme par kilogramme peut entraîner une mortalité de 5 %. La mortalité pourrait encore augmenter chez les rats plus jeunes ou plus âgés ou les rats femelles enceintes. Retournez les rats dans leurs cages après l’injection de LPS, et fournissez à ad libitum l’accès à la nourriture et aux boissons.
Sous anesthésie terminale, effectuer une ponction cardiaque profonde de cinq à huit millimètres sur chaque rat. Le point de perforation doit être de cinq millimètres à la marge gauche du sternum aux troisième et quatrième espaces intercostals. Maintenez l’aiguille en place et remplacez le tube vide par un tube contenant du bleu Evans.
Attendez que la récupération sanguine soit observée, puis injectez evans bleu à une dose de 0,2 millilitres par 100 grammes de poids corporel dans le ventricule cardiaque gauche. Gardez le rat en position supine pendant 10 minutes si vous évaluez la fuite bleue d’Evans par la barrière du sang et de la cervelle par imagerie par immunofluorescence. Effectuer des perfusions cardiaques à l’aide de glace froide 200 à 300 millilitres de solution saline de 0,9% pour effacer la vascularisation cérébrale et le cerveau.
Passez au paraformaldéhyde glacé à 4 % pour la fixation. Puis, après avoir isolé le cerveau, immerger dans 20% saccharose dans PBS pendant au moins six heures ou jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du tube. Changez la solution en saccharose à 30% et fixez-la pendant encore six heures.
Enfin, préparez des sections de tissu cérébral de 10 millimètres d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Lavez les diapositives avec PBS trois fois pendant cinq minutes chacune, puis incuber les diapositives avec 4, 6'diamidino-2-phenylindole ou DAPI solution pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les glissières dans PBS comme avant, monter les diapositives avec la solution PBS-glycérol.
Capturez des images au microscope à fluorescence. Le dépôt d’EB est indiqué par fluorescence rouge, les noyaux sont indiqués par fluorescence bleue. Commencez à colorer h&e en lavant les toboggans dans de l’eau distillée.
Puis plonger dans la solution d’hématoxyline pendant huit minutes. Alternativement, pour la coloration bleue prussienne perl, tache dans la solution de réaction avec le mélange à parts égales de ferrocyanure et d’acide chlorhydrique pendant 10 minutes. Après coloration, laver l’eau courante du robinet pendant cinq minutes.
Différencier en 1% d’alcool acide pendant 30 secondes. Après le lavage dans l’eau courante du robinet pendant une minute, colorer dans 0,2% d’eau ammoniac ou de solution saturée de carbonate de lithium pendant 30 secondes à une minute. Ensuite, laver dans l’eau courante du robinet pendant cinq minutes.
Contre-tache avec solution d’éosine pendant 30 secondes à une minute. Déshydrater à 90% d’alcool, puis 95% d’alcool, et l’alcool absolu pendant 0,5 à deux minutes chacun. Après déshydratation, clair dans le xylène pendant 30 secondes.
Après montage, analysez la coloration H&E à l’aide d’un microscope à fluorescence brillant. Les globules rouges libérés par les vaisseaux sanguins, qui sont des composants des CMH, apparaissent en rouge-orange sous la coloration H&E. Les CMH de surface peuvent être détectés par observation brute comme indiqué par les flèches rouges.
La coloration bleue Evans révèle une fluorescence rouge visible où des molécules bleues Evans ont fui d’une barrière céphalo-céphalo-encéphalique blessée. La coloration H&E montre des globules rouges trouvés à l’extérieur des capillaires, et la coloration prussienne révèle des points d’ions ferriques dérivés de la lyse des globules rouges. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la dose de LPS pour induire la micro-hémorragie cérébrale est plus grande que celle utilisée dans la maladie de Parkinson ou le modèle de schizophrénie.
Par conséquent, l’environnement des animaux doit être maintenu propre pour réduire le taux de mortalité. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie électronique, la formation image de résonance magnétique, et la formation image immunofluorescente pourraient être exécutées pour déterminer les dommages à la structure externe de la barrière hémato-encéphalique dans la micro-hémorragie cérébrale, la distribution des micro-hémorragies cérébrales dans le parenchyme de cerveau in vivo, aussi bien que l’activation de cellules gliale.
