La signalisation de redox dysregulated est impliquée dans la pathogénie de diverses maladies. L’étude de la biologie du redox nécessite la détection précise d’espèces réactives d’oxygène dans différents compartiments cellulaires et tissulaires. La spectroscopie EPR est la seule méthode qui mesure sans ambiguïté les radicaux libres.
Ce protocole démontre une méthode pratique pour la manipulation et le stockage d’échantillons biologiques pour la spectroscopie EPR. Ces protocoles illustrent l’utilisation d’EPR et de sondes spin dans deux modèles représentatifs. Bien qu’ils puissent être adaptés pour évaluer les espèces actives dans d’autres milieux biologiques.
La conception de l’expérience et la manipulation de l’échantillon sont essentielles à sa reproductibilité. Nous vous recommandons d’envisager la densité cellulaire et d’assurer des contrôles adaptés au temps. Commencez par laver doucement les cellules brutes de 264,7 avec un millilitre de Tampon Krebs-Henseleit ou KHB, par puits.
Et traiter les cellules avec 500 microlitres de KHB, complétées par 100 micromil de DTPA par puits. Pour prétraiter avec la dismutase de superoxyde, ajoutez 15 microlitres de stock de dismutase de superoxyde, ou véhicule, à chaque puits, et placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin du prétraitement de dismutase de superoxyde, ajoutez 12,5 microlitres de CMH de 10 millimolaires et 40 microlitres de 125 micromolar PMA solution de travail aux puits appropriés, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes.
Placez immédiatement les plaques sur la glace et recueillez le tampon de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de KHB frais plus DTPA à chaque puits et grattez doucement les cellules du fond de chaque puits. Puis résuspendez les suspensions cellulaires avec pipetting et transférez les cellules dans des tubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace.
Pour la détection du superoxyde à température ambiante, chargez d’abord 50 microlitres d’un tampon ou d’un échantillon cellulaire dans un tube capillaire et scellez le tube. Placez immédiatement le tube dans le spectromètre paramagnetic électronique, ou EPR, et définissez les paramètres d’acquisition de l’EPR pour les mesures de température ambiante. Testez toujours un échantillon vierge de tampon contenant la même concentration de sonde traitée dans les mêmes conditions expérimentales qu’un contrôle.
Pour la détection du superoxyde à 77 degrés Kelvin, chargez 150 microlitres d’un échantillon dans un morceau de polytétrafluoroéthylène droit d’un à deux pouces, ou PTFE, tube, avec un bouchon en caoutchouc à une extrémité. Sceller l’autre extrémité du tube à l’intérieur d’un deuxième bouchon et congeler l’échantillon dans de l’azote liquide. Retirez ensuite rapidement les bouchons et placez le tube PTFE dans un cryotube étiqueté pour le stockage de l’azote liquide.
Pour les mesures EPR, remplissez le déwar doigt du spectromètre EPR avec de l’azote liquide et placez le tube PTFE contenant l’échantillon dans l’azote liquide. Placez le bout des doigts dans le spectromètre EPR et définissez les paramètres d’acquisition de l’EPR pour les mesures à 77 degrés Kelvin. Pour la détection ros dans les tissus pulmonaires congelés, placez le tissu sur la glace sèche et utilisez des pinces à épiler pour stabiliser le tissu flash-congelé sur la glace sèche.
Couper l’échantillon en cinq morceaux de 15 milligrammes et peser les morceaux dans un tube goudronné de 1,5 millilitre. Ajouter 196 microlitres de KHB plus DTPA et quatre microlitres de CMH à l’échantillon, et incuber l’échantillon pulmonaire pendant une heure dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius avant de pelleter les fragments de tissu avec une brève centrifugation. Placez ensuite l’échantillon sur la glace avant de transférer 150 microlitres du supernatant dans un morceau de tube PTFE pour le gel flash en préparation de la mesure epr comme nous venons de le démontrer.
L’évaluation de la production totale de superoxyde dans les cellules brutes de 264,7 stimulées par la PMA comme démontré, révèle que la concentration de nitroxide dans la suspension cellulaire et le tampon des cellules traitées par pma est similaire, en raison de la nature perméable et de l’équilibrage rapide de la sonde spin. Le signal des radicaux nitroxides augmente dans les cellules brutes de 264,7 stimulées par pma, par rapport aux cellules de contrôle, mais pas dans les cellules prétraitées avec la dismutase de superoxyde cellule-imperméable. La concentration de nitroxide obtenue à basse température dans 264,7 cellules brutes après stimulation par PMA est également atténuée en présence d’une dismutase de superoxyde compatible avec les données sur la température ambiante.
La concentration de nitroxide est augmentée dans le sang et le liquide de lavage bronchoalveolar des souris bleo et des souris traitées, aussi bien qu’à l’intérieur des supernatants des morceaux récoltés de tissu de poumon des souris de bleo et des animaux blessés, comparés aux contrôles PBS-traités. En outre, après injection rétro-orbitale de sonde de spin, les souris de bleo et les animaux traités démontrent un signal plus élevé de sonde de spin comparé aux contrôles. Ces protocoles pratiques permettront aux chercheurs de tester la production de radicaux libres dans différents compartiments cellulaires et échantillons biologiques par EPR, y compris des mesures à basse température.
