Nous avons présenté iSCAT pour la première fois en 2004 dans le cadre de la détection et de la spectroscopie des nanoparticules d’or. Au cours des 10 années qui ont suivi, nous avons développé cette technique pour la détection et le suivi des nanoparticules biologiques comme les virus et les petites protéines. L’essence de la technique est que tout objet matériel, aussi petit soit-il, a une section transversale d’extinction finie.
Le principal avantage de cette technique est la détection sans étiquette. Cela signifie que si nous sommes assez sensibles, nous pouvons détecter à peu près n’importe quoi, comme des protéines ou des exosomes sécrétés à partir de cellules individuelles. La question que l’on doit faire attention est de savoir comment traiter l’arrière-plan de diffusion.
Un grand avantage d’un microscope iSCAT est qu’il peut être entièrement construit à la maison et il peut être ajouté à un microscope commercial existant. Cela signifie qu’il peut être facilement combiné avec d’autres techniques optiques, telles que la fluorescence, et c’est l’une des raisons pour lesquelles de nombreux groupes utilisent également maintenant iSCAT et les techniques connexes. Ici, nous utilisons les cellules LUZ comme un système modèle pour montrer la détection des protéines individuelles et sécrétaires.
Cependant, cette méthode peut également être appliquée pour sonder presque n’importe quel processus biologique au niveau moléculaire. Pour obtenir un microscope stable, commencez par une table optique amortie et un bloc massif rigide pour l’étape de l’échantillon. Construisez une étape d’échantillon de microscope qui incorpore un objectif d’ouverture numérique élevé et une unité de traduction qui permet la traduction latérale d’échantillon aussi bien que le changement de position de foyer pour l’objectif.
Utilisez un miroir de couplage vertical de 45 degrés et une lentille singlet de longueur focale de 50 centimètres pour concentrer la lumière d’un laser à diodes à longueur d’onde 445 nanomètres sur le plan focal arrière de l’objectif. Cette lentille de champ large crée un faisceau collimated à la mise au point vers l’avant de l’objectif, qui deviendra la source d’éclairage iSCAT. Appliquez une gouttelette d’huile d’immersion sur l’objectif et placez un couvercle en verre dans le plan d’échantillon de l’étape du microscope.
Il en résultera un faisceau qui se reflète vers le bas à travers l’objectif d’imagerie. Pour mettre en place la trajectoire d’imagerie, introduisez un beamsplitter enduit anti-reflet à un angle de 45 degrés par rapport au faisceau incident et d’environ 10 centimètres après la lentille de champ large. Assurez-vous que le revêtement anti-reflet pointe vers la source laser.
Faites attention car un beamsplitter épais introduira le déplacement significatif de faisceau de sorte que le laser pourrait ne pas entrer dans l’objectif droit plus. Si nécessaire, réalignez la trajectoire du faisceau laser devant le beamsplitter pour assurer la propagation correcte à travers l’objectif. Pour s’assurer que le plan de l’échantillon et la caméra sont parfocals, commencez par placer une lentille concave avec une longueur focale négative de 45 centimètres à une position cinq centimètres après la lentille de champ large dans la trajectoire du faisceau incident.
Il en résultera un faisceau collimé entrant dans l’ouverture arrière de l’objectif. Avec l’écran placé dans le bras réfléchissant de l’interféromètre, déplacez l’objectif dans la direction verticale pour trouver la position focale grossière. L’objectif est au point lorsque le faisceau frappant l’écran est rassemblé.
Retirez à la fois l’objectif négatif de la longueur focale et l’écran lorsque la mise au point grossière est terminée. Ajoutez une deuxième lentille monocette de 50 centimètres de longueur focale pour concentrer la lumière éparse et pour collimate la lumière réfléchie. Assurez-vous que la lentille est placée à 50 centimètres du plan focal arrière de l’objectif de sorte que le faisceau laser transmis soit de nouveau rassemblé.
Pour compléter l’assemblage de configuration iSCAT, placez la caméra CMOS à 50 centimètres de l’objectif focal de 50 centimètres et placez le faisceau directement sur le milieu de la puce. Pour mettre en place des canaux d’imagerie supplémentaires, couplez la sortie d’une source lumineuse LED en un objectif à longue distance de travail. Installez des composants mécaniques au-dessus de la chambre d’échantillonnage qui permettent de concentrer et de positionner latéralement la sortie LED sur l’échantillon.
Déplacez l’objectif supérieur latéralement de sorte que l’objectif supérieur de champ large et l’objectif inférieur d’iSCAT soient colinear. Ceci est déterminé en plaçant un écran sous l’objectif inférieur et en maximisant l’intensité de la lumière LED transmise sur l’écran. Maintenant, placez un miroir dichroïque de passage court de 550 nanomètres pour diviser la lumière transmise de LED de la trajectoire laser d’iSCAT.
Divisez ce faisceau en deux canaux avec un beamsplitter réfléchissant de huit pour cent, 92 pour cent transmissif. Le chemin de 92 pour cent est le canal de fluorescence, et le chemin de huit pour cent est utilisé pour l’imagerie brightfield. Image du canal brightfield sur une caméra CMOS à l’aide d’un objectif doublet achromatique de longueur focale de cinq centimètres.
Imagez le canal de fluorescence sur une caméra CMOS séparée à l’aide d’une lentille achromatique à doublette de longueur focale de cinq centimètres. En outre, utilisez un filtre longpass de 600 nanomètres pour bloquer la lumière d’excitation. Pour configurer l’ordinateur et le logiciel, connectez toutes les caméras à un ordinateur.
Sur la configuration entièrement assemblée, observez l’image iSCAT sur la caméra CMOS et assurez-vous qu’elle est au point en trouvant une poussière résiduelle ou une particule de saleté sur le couvercle en verre. Vérifiez que l’image de la particule est une fonction de propagation circulairement symétrique du point. La fonction de propagation de point n’aura pas une forme circulaire si le faisceau laser entre dans l’objectif du microscope à un léger angle.
Ceci peut être corrigé par un léger ajustement du miroir de 45 degrés pour assurer un couplage droit dans l’objectif. Comparez les images de la caméra du champ lumineux et des canaux de fluorescence. Assurez-vous que les deux sont au point, et afficher la même zone en imagerie d’une perle fluorescente ou un échantillon de cellule.
Vérifiez que la position du laser iSCAT est approximativement au centre de l’image, et prenez note de sa position pour référence ultérieure. Pour changer la position et le champ de vision du champ lumineux et du canal de fluorescence, déplacez les caméras sur la table en ce qui concerne les lentilles de mise au point. Préparez-vous à l’expérience tel que détaillé dans le protocole texte.
Cela comprend la préparation des cellules et du milieu de microscopie, ainsi que la cuvette échantillon microscope. Assurez-vous que le faisceau laser est bloqué pour empêcher les cellules d’être directement exposées à la lumière laser iSCAT. Injecter environ trois microlitres de l’échantillon de cellules préparées légèrement hors du centre dans la cuvette de l’échantillon.
Touchez doucement la pointe pipette à la fiche de couverture et injectez lentement la solution cellulaire. Laissez les cellules s’installer sur le coverslip. Vérifiez le nombre de cellules proches du laser iSCAT.
Si le nombre de cellules est trop faible, répétez cette étape jusqu’à ce qu’un nombre suffisant soit disponible. Si la couverture des cellules est trop dense, utilisez une injection d’environ 20 microlitres de microscopie supplémentaire pour disperser les cellules à travers le coverslip. À l’aide de l’étape de traduction piezoélectrique, déplacez l’échantillon latéralement pour positionner une cellule près du champ de vision iSCAT.
Assurez-vous que la cellule n’entre pas dans le champ de vision de l’iSCAT, car l’exposition directe à la lumière laser de 445 nanomètres pourrait être nocive pour la cellule. Débloquez le faisceau laser iSCAT et assurez-vous que la surface du coverslip est toujours au point. Enfermez la table d’isolement pour minimiser la dérive et le couplage acoustique de l’environnement ambiant.
Commencez la mesure en acquérant des images des caméras iSCAT, brightfield et fluorescence. Vérifiez périodiquement la viabilité de la cellule et l’orientation du système. Ici, un logiciel de microscope auto-écrit est utilisé pour afficher les images de la caméra.
Ici, l’imagerie différentielle est effectuée en temps réel par soustraction de cadres consécutifs pour rendre visibles les liaisons protéiques. Il en résulte une image filtrée qui est visible sur l’écran avec l’image brute de la caméra. Les résultats représentatifs d’une expérience de sécrétion cellulaire réalisée avec iSCAT sont présentés ici.
La vidéo montre les sécrétions d’une cellule LAZ sur une période de deux minutes. Les images iSCAT différentielle sur la gauche visualisent l’absorption de protéines simples sur le verre de couverture. Les images brillantes et le canal de fluorescence sur la droite sont utilisés pour surveiller la viabilité des cellules.
Cet histogramme montre les protéines détectées et leur plage de contraste dans cette période de deux minutes. Les données ont été recueillies en analysant les événements de liaison individuels dans chaque image des données vidéo iSCAT à l’aide d’un algorithme de recherche de pic personnalisé. La microscopie ISCAT n’est pas seulement un outil puissant en biocaptation, mais aussi en microscopie, car elle permet la détection sans étiquette de nano-objets en temps réel.
En particulier, il peut être appliqué à une variété de processus tels que la diffusion et le transport des protéines. En raison de sa sensibilité exquise à la diffusion de la lumière, iSCAT peut détecter n’importe quelle protéine ou entité dans le champ de vision. Bien sûr, cela signifie également que la technique n’a pas la spécificité que la fluorescence apporte le long, mais pour contourner ce problème, on peut appliquer des méthodes supplémentaires comme la fonctionnalisation de surface pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt.
N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être dangereux, et une protection oculaire appropriée doit toujours être porté lors de l’assemblage et l’ajustement du microscope. La détection en temps réel des sécréomes est très excitante et un grand saut dans le diagnostic médical, qui nécessite actuellement beaucoup plus de temps et est très loin de la sensibilité aux protéines. Il y a encore beaucoup de place pour améliorer les performances de la méthode et étendre ses applications.
Nous espérons donc que cette vidéo aidera d’autres groupes à se joindre à cet effort passionnant.
