Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme tels que, comment l’activité métabolique est modifiée au cours du processus de vieillissement. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation d’un segment du corps intact qui a des données qui ressemble étroitement à l’état naturel et physiologique par rapport à l’isolement mitochondrial classique. Anuroop et Annika, une étudiante diplômée de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Pour commencer le protocole, allumez la machine une heure avant de commencer l’expérience afin qu’il y ait suffisamment de temps pour atteindre la température désirée et rester stable. Ensuite, dans la configuration du logiciel, en mode administration, choisissez la longueur de l’étalonnage de la cartouche et la température désirée. Ensuite, entrez le protocole suivant: Selon la conception expérimentale, ajouter des étapes d’injection des ports A à D après une étape de mesure choisie.
Pour vérifier la qualité et la détermination de l’OCR basal, ajustez le protocole pendant au moins trois cycles de mesure avant de régler l’injection du premier médicament via le port A.Pré-calibrer la cartouche un jour, ou au moins quatre heures avant le test, en ajoutant 1,0 millilitres de calibreur à chaque puits, et placez la cartouche du capteur sur le dessus de la plaque. Couvrir la cartouche de Parafilm si elle doit s’hydrater pendant plus de 24 heures pour éviter l’évaporation. Conserver la cartouche à 37 degrés Celsius sans CO2, pendant la nuit.
Ensuite, assurez-vous que les médicaments expérimentaux sont complètement dissous dans un milieu frais, plus 2,5% de glucose. Mesurez et ajustez le pH de la solution médicamentable au pH du véhicule à la température désirée. Pipette la solution de drogue dans son port d’injection alloué.
Chargez ensuite la cartouche dans la machine et commencez l’étalonnage. Ajustez les supports fraîchement préparés plus 2,5% de glucose au pH désiré avec un HCl normal. Ensuite, préparez une glacie et placez une plaque de métal sur la glace.
Ouvrez le paquet de plaque d’oeillet. Plongez les filets dans les médias par une boîte petri de 16 millimètres. Recueillir un filet avec l’inserteur et faire tenir l’inserteur à côté du microscope.
Ajouter une petite goutte de supports au filet fixé à l’inserteur. Ensuite, anesthésier les mouches en les plaçant sur une plaque de métal glacée. À l’aide de forceps, saisir l’abdomen d’une mouche et l’immerger dans les médias dans une boîte de Pétri sous le microscope.
À l’aide d’une deuxième paire de forceps, retirer délicatement la tête de la mouche. Placez la tête au milieu du filet fixé à l’inserteur et vérifiez que la tête est immergée dans les médias. Retirer le liquide superflu avant de centrer les têtes pour éviter de perdre la tête tout en les plaçant dans le puits.
Quand il y a 16 têtes sur le net, centrez-les. À l’aide de l’inserteur, placer le filet dans le puits. Assurez-vous que les têtes sont piégées sous le filet et ajoutez lentement 700 microlitres de médias plus 2,5% de glucose.
Assurez-vous que les puits vides, qui sont utilisés pour l’arrière-plan, contiennent également un filet avec 700 microlitres du tampon plus 2,5% de glucose. Vérifiez les puits pour les bulles d’air sous les filets au microscope. Pipette doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette d’un millimètre pour enlever les bulles.
Gardez les têtes centrées pour une lecture OCR fiable. Ensuite, ajoutez la plaque à la machine et démarrez la mesure. À la fin du protocole, retirez la cartouche.
Confirmez visuellement qu’il n’y a pas de restes visibles dans les obturations bâbord. Ensuite, jetez la cartouche et la plaque si les têtes ne doivent pas être utilisées pour l’extraction des protéines. N’oubliez pas de regarder les niveaux d’oxygène et de pH, afin de détecter les puits anormaux avant l’analyse.
En outre, il est important de choisir le calcul approprié du taux de consommation d’oxygène, en fonction des niveaux d’oxygène. Lors de l’exécution du protocole, il a été observé que les niveaux d’oxygène des têtes de la quarantaine ont chuté plus rapidement que les jeunes têtes volantes. Lorsque la gamme des niveaux d’oxygène est similaire entre les conditions, il est préférable d’utiliser l’algorithme AKOS pour générer automatiquement le taux de consommation d’oxygène, ou OCR, qui reflète de façon fiable les changements de niveau d’oxygène lors d’une mesure entre les jeunes et les têtes de la quarantaine.
L’ajout de butyrate de sodium, ou SB, un inhibiteur du KDAC, modifie transitoirement la dynamique des niveaux d’oxygène. Alors que les commandes du véhicule affichent des niveaux réguliers d’oxygène pendant les première et dernière tiques, l’ajout de SB provoque une baisse considérable et transitoire des niveaux d’oxygène dans ces tiques. Étant donné que le calcul AKOS tient compte de toutes les tiques et ignore un état anoxique, il génère un OCR trompeur, comme on l’observe dans les niveaux non normalisés d’OCR basés sur l’AKOS, qui montrent peu de changement lors de l’injection du port A.L’algorithme fixe, qui modèle et ressemble plus étroitement aux changements de niveau d’OCR et d’oxygène, révèle un OCR accru sur le traitement de SB.
Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de travailler avec deux personnes ensemble afin d’assurer un temps relativement court pour préparer une seule plaque. Après cette procédure, d’autres méthodes biochimiques, telles que la tache occidentale et la spectrométrie de masse peuvent être exécutées pour répondre aux questions liées aux mécanismes moléculaires, par exemple, ceux qui modèrent des changements métaboliques.
