Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метаболизма, такие как, как метаболическая активность изменяется в процессе старения. Основным преимуществом этого метода является использование нетронутого сегмента тела, который имеет данные, которые очень напоминают естественное и физиологическое состояние по сравнению с классической митохондриальной изоляции. Демонстрация процедуры будет Anuroop и Анника, аспирант в моей лаборатории.
Чтобы начать протокол, включите машину за час до начала эксперимента, чтобы было достаточно времени, чтобы достичь желаемой температуры и оставаться стабильным. Затем, в настройке программного обеспечения, в режиме администрирования, выберите длину калибровки картриджа и нужную температуру. Затем введите следующий протокол: В зависимости от экспериментальной конструкции добавьте шаги впрыска из портов A в D после выбранного этапа измерения.
Чтобы проверить качество и определение базального OCR, отрегулируйте протокол по крайней мере в течение трех циклов измерения, прежде чем установить инъекцию первого препарата через порт A.Pre-калибровать картридж один день, или по крайней мере за четыре часа до тестирования, добавив 1,0 миллилитров калибра к каждой хорошо, и поместите датчик на верхней части пластины. Обложка картриджа с Parafilm, если планируется гидрат в течение более 24 часов, чтобы предотвратить испарение. Храните картридж при 37 градусах Цельсия без CO2, на ночь.
Далее убедитесь, что экспериментальные препараты тщательно растворяются в свежей среде, плюс 2,5% глюкозы. Измерьте и отрегулируйте рН лекарственного раствора до рН транспортного средства при желаемой температуре. Pipette раствор препарата в его выделено инъекционный порт.
Затем загрузите картридж в машину и начните калибровку. Отрегулируйте свежеприготовленные средства массовой информации плюс 2,5% глюкозы до нужного рН с одним нормальным HCl. Затем приготовьте ледяную коробку и поместите металлическую пластину на лед.
Откройте пакет глазной пластины. Погрузите сети в средства массовой информации на 16 миллиметров Петри блюдо. Соберите одну сетку с вставщиком и вставщик встать рядом с микроскопом.
Добавьте небольшую каплю мультимедиа в сетку, прикрепленную к вставке. Затем обезболивать мух, поместив их на ледяную металлическую пластину. Используя типсы, возьмите живот мухи и погрузите его в средства массовой информации в чашку Петри под микроскопом.
Используя вторую пару типсов, аккуратно снимите голову мухи. Поместите голову в середину сетки, прикрепленной к вставке, и убедитесь, что голова погружена в средства массовой информации. Удалите лишнюю жидкость, прежде чем центрирование головы, чтобы избежать потери головы при размещении их в колодец.
Когда в сети 16 голов, центр их. Используя вставку, поместите сетку в колодец. Убедитесь, что головы оказались в ловушке под сетью и медленно добавить 700 микролитров средств массовой информации плюс 2,5% глюкозы.
Убедитесь, что пустые скважины, которые используются для фона, также содержат сеть с 700 микролитров буфера плюс 2,5% глюкозы. Проверьте колодцы на наличие пузырьков воздуха под сетями с помощью микроскопа. Pipette мягко вверх и вниз с помощью одного миллиметра пипетки, чтобы удалить любые пузырьки.
Держите головы по центру для надежного чтения OCR. Затем добавьте пластину в машину и начните измерение. В конце протокола удалите картридж.
Визуально подтвердите, что в начинках порта нет видимых остатков. Затем отбросьте картридж и тарелку, если головки не будут использоваться для извлечения белка. Не забудьте посмотреть на кислород и уровень рН, для того, чтобы обнаружить любые ненормальные скважины до анализа.
Кроме того, важно выбрать соответствующий расчет скорости потребления кислорода, в зависимости от уровня кислорода. При выполнении протокола было отмечено, что уровень кислорода в головах среднего возраста упал быстрее, чем у молодых мухомодеров. Когда диапазон уровней кислорода аналогичен между условиями, лучше использовать алгоритм AKOS для автоматического генерации скорости потребления кислорода, или OCR, который надежно отражает изменения уровня кислорода во время измерения между молодыми и среднего возраста головы.
Добавление бутирата натрия, или SB, ингибитора KDAC, преходяще изменяет динамику уровней кислорода. В то время как управление транспортным средством отображает устойчивый уровень кислорода в течение первого и последнего клещей, добавление SB вызывает значительное и переходное падение уровня кислорода в этих клещей. Поскольку расчет AKOS учитывает всех клещей и игнорирует аноксическое состояние, он генерирует вводящий в заблуждение OCR, как это наблюдается в ненормативных уровнях OCR на основе AKOS, которые показывают небольшое изменение при инъекциях порта A.The фиксированный алгоритм, который более тесно моделирует и напоминает изменения ocR и уровня кислорода, показывает увеличение OCR при лечении SB.
При попытке этой процедуры, важно работать с двумя людьми вместе, с тем чтобы обеспечить относительно короткий промежуток времени, чтобы подготовить одну пластину. После этой процедуры, другие биохимические методы, такие как Западная пятно и масс-спектрометрия могут быть выполнены, чтобы ответить на вопросы, связанные с молекулярными механизмами, например, те, которые умеренные метаболические изменения.
