Bu yöntem metabolizma alanında temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, nasıl metabolik aktivite yaşlanma sürecinde değiştirilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, klasik mitokondriyal izolasyona kıyasla doğal ve fizyolojik duruma çok benzeyen verilere sahip sağlam bir vücut segmentinin kullanılmasıdır. Prosedürü gösteren Anuroop ve Annika, benim laboratuvarda yüksek lisans öğrencisi olacaktır.
Protokolü başlatmak için, deneye başlamadan bir saat önce makineyi açın, böylece istenilen sıcaklığa ulaşmak ve sabit kalmak için yeterli zaman vardır. Daha sonra, yazılım kurulumunda, yönetim modu altında, kartuş kalibrasyonunun uzunluğunu ve istenilen sıcaklığı seçin. Ardından, aşağıdaki protokolü girin:Deneysel tasarıma bağlı olarak, seçilen bir ölçüm adımından sonra A'dan D'ye enjeksiyon adımları ekleyin.
Kaliteyi ve bazal OCR'nin belirlenmesini kontrol etmek için, protokolü a.Pre-calibratile bağlantı noktası üzerinden ilk ilacın enjeksiyonuna ayarlamadan önce en az üç ölçüm döngüsü için ayarlayın, kartuşun testten en az dört saat önce, her kuyuya 1,0 mililitre camil ekleyerek ve sensör kartuşunu plakanın üzerine yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için 24 saatten fazla nemlendirmek için planlanmışsa kartuşun üzerini Parafilm ile kapatın. Kartuşu bir gecede CO2 olmadan 37 derecede saklayın.
Daha sonra, deneysel ilaçların taze ortamda ve %2,5 glikozda iyice çözünmesini sağlayın. İlaç çözeltisinin pH'ını istenilen sıcaklıkta aracın pH'ına göre ölçün ve ayarlayın. Pipet ilaç çözeltisi içine ayrılmış enjeksiyon portu.
Daha sonra kartuşun makineye yüklenmesini ve kalibrasyona başlayabilirsiniz. Taze hazırlanmış ortam artı %2,5 glikozu istenilen pH'a normal bir HCl ile ayarlayın. Sonra, bir buz kutusu hazırlayın ve buz üzerine metal bir plaka yerleştirin.
Göz bebeği plaka paketini açın. 16 milimetre Petri çanak tarafından medya ağları batırın. Kesici ile bir ağ toplayın ve inserter mikroskop yanında stand up var.
Kesici uçlayıcıya bağlı ağa küçük bir ortam damlası ekleyin. Daha sonra, buz gibi metal bir plaka üzerine yerleştirerek sinekanestezi. Forceps kullanarak, bir sinek karın kapmak ve mikroskop altında bir Petri kabında medya batırın.
İkinci bir çift forceps kullanarak, yavaşça sinek başını çıkarın. Başlığı kesiciye bağlı ağın ortasına yerleştirin ve başın ortama daldırıldığından doğrulayın. Kuyuya yerleştirirken kafaları kaybetmemek için kafaları ortalamadan önce gereksiz sıvıyı çıkarın.
İnternette 16 kafa olduğunda, onları merkeze ver. Kesici yi kullanarak, ağı kuyuya yerleştirin. Kafaları net altında sıkışıp olduğundan emin olun ve yavaş yavaş medya 700 mikrolitre artı% 2.5 glikoz ekleyin.
Arka plan için kullanılan boş kuyuların tamponun 700 mikrolitresi artı %2,5 glikoz içeren bir ağ içerdiğinden emin olun. Mikroskop aracılığıyla ağların altındaki hava kabarcıkları için kuyuları kontrol edin. Pipet yavaşça yukarı ve aşağı herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için bir milimetrelik pipet kullanarak.
Kafaları güvenilir bir OCR okuması için ortalayın. Sonra makineye plaka ekleyin ve ölçüm başlar. Protokolün sonunda, kartuşunu çıkarın.
Port dolgularında görünür artık olmadığını görsel olarak doğrulayın. Daha sonra, kafaları protein çıkarma için kullanılmaz ise kartuş ve plaka atın. Analiz den önce herhangi bir anormal kuyu tespit etmek için oksijen ve pH düzeylerine bakmayı unutmayın.
Ayrıca, oksijen düzeylerine göre uygun oksijen tüketim oranı hesaplaması seçmek önemlidir. Protokolün yapıldıktan sonra orta yaş kafalarının oksijen seviyesinin genç sinek kafalardan daha hızlı düştüğü gözlenmiştir. Oksijen düzeylerinin aralığı koşullar arasında benzer olduğunda, oksijen tüketim hızını otomatik olarak oluşturmak için AKOS algoritmasını kullanmak daha iyidir veya genç ve orta yaş kafaları arasındaki ölçüm sırasında oksijen seviyesi değişikliklerini güvenilir bir şekilde yansıtan OCR.
Sodyum bütirat eklenmesi, veya SB, Bir KDAC inhibitörü, geçici oksijen düzeylerinin dinamikleri değiştirir. Araç kontrolleri ilk ve son keneler sırasında sabit oksijen seviyeleri gösterirken, SB ilavesi bu kenelerdeki oksijen seviyelerinde önemli ve geçici bir düşüşe neden olur. AKOS hesaplaması tüm keneleri göz önünde bulundurup anoksik durumu göz ardı ettiği için, normalleşmemiş AKOS tabanlı OCR seviyelerinde gözlendiği gibi yanıltıcı bir OCR oluşturur ve bu da A.The bağlantı noktasının enjeksiyonu yla çok az değişiklik gösterir ve OCR ve oksijen seviyesi değişikliklerini daha yakından modelleyen ve andıran sabit algoritma, SB tedavisi üzerine artan bir OCR'yi ortaya çıkarır.
Bu yordamı denerken, tek bir plaka hazırlamak için göreceli kısa bir süre sağlamak için birlikte iki kişi ile çalışmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, Batı Blot ve kütle spektrometresi gibi diğer biyokimyasal yöntemler moleküler mekanizmalar ile ilgili soruları cevaplamak için yapılabilir, örneğin, bu Orta metabolik değişiklikler.
