Ainsi, le principal avantage de notre nouvelle technique, nous l’avons appelé E plus E, qui signifie enrichissement plus expansion, est que nous pouvons enrichir et étendre ces cellules, cellules rares spécifiques aux antigènes, simultanément. Cela nous permet de développer un nombre suffisant de cellules que nous allons être en mesure d’utiliser pour étudier leur rôle dans différents contextes et dans différents contextes cliniques ou même nous permet de développer maintenant un grand nombre de cellules que nous pouvons utiliser pour l’immunothérapie d’une manière que nous ne pouvions pas avant. La méthode que nous avons développée, ce E plus E, peut aider à répondre à des questions clés en immunologie de base sur la présence de néoepitopes.
Qu’est-ce que les néoepitopes? Ce sont les épitopes personnalisés que nous savons sont maintenant très importants en termes d’immunothérapie du cancer et aussi la dynamique spécifique aux antigènes et comment ces facteurs affectent les états de la maladie et pour une thérapie cellulaire efficace. Les implications de cette technique s’étendent vers l’immunothérapie, car la cellule artificielle d’antigène-présentation de nanoparticule pourrait être un produit disponible sur le marché qui est facilement adapté aux réponses immunisées individuelles de patient.
Pour générer des cellules artificielles de présentation d’antigènes nanoparticules, résuspendez les particules lyophilisées en un millilitre de tampon de resuspension et vortex vigoureusement la suspension pendant au moins 15 minutes jusqu’à ce qu’aucun agrégat ne soit visible. Les particules qui ne sont pas suffisamment vortexées et résuspendées avant la réaction avec la protéine entraîneront de plus grosses particules agrégées qui ne peuvent pas être dissociées. Placez les particules magnétiques sur un support magnétique pour enlever le supernatant et les resuspendre avec 0,5 millilitres de tampon de resuspension fraîche.
Transférer la suspension des particules dans un flacon de scintillation en verre pour le vortex jusqu’à ce qu’aucun agrégat ne soit visible, et ajouter 0,1 milligramme de signaux stimulateurs totaux par milligramme de particules résuspendées. Après le vortex, laisser la suspension réagir pendant 2,5 heures à température ambiante en mélangeant dans un rotateur, suivie de l’ajout de 0,1 millilitres de tampon d’assaisissement pour une incubation supplémentaire de 30 minutes à température ambiante avec mélange. À la fin de la deuxième réaction, placez le flacon de scintillation sur le support magnétique et lavez les particules en un millilitre de tampon de resuspension quatre fois, en enlevant le tampon lorsqu’il devient clair après chaque lavage et en le remplaçant par un tampon de resuspension frais pour le lavage ultérieur sur l’aimant.
Après le dernier lavage, aspirez la solution et retirez les particules du support magnétique, puis stockez les particules dans un millilitre de tampon de resuspension fraîche à quatre degrés Celsius pendant une période jusqu’à six mois. Pour isoler les cellules CD8+T spécifiques aux antigènes, macérer les rates et les ganglions lymphatiques des souris noires de type C57 6J sauvages à travers une passoire cellulaire stérile de 70 micromètres avec des rinçages PBS fréquents et utiliser un kit d’isolation cellulaire CD8+T sans contact selon les instructions du fabricant pour éliminer les cellules NON CD8+T. Après comptage, recueillir les cellules CD8+T isolées par centrifugation et résuspendre la pastille dans 100 microlitres de PBS complétés par 0,5% d’albumine de sérum bovin et edta de deux millimolaires, puis incuber les cellules avec les cellules artificielles de présentation d’antigène nanoparticules de telle sorte qu’il y ait une fois 10 à la 11ème MHC-ig peptide-chargée par une fois 10 à la sixième cellule isolée de CD8+T dans un stérile , tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres pendant une heure à quatre degrés Celsius avec mélange continu.
À la fin de l’incubation, laver la suspension des cellules nanoparticules trois fois sur le support magnétique comme démontré, en résustant les cellules artificielles présentant des antigènes et les cellules CD8+T enrichies dans 500 microlitres de milieu frais et complété avec 1% de facteur de croissance des lymphocytes T après le dernier lavage. Pour une récupération maximale des cellules, il est essentiel de laisser les particules et les cellules sur la colonne magnétique pendant au moins deux minutes et d’aspirer soigneusement le tampon sans perturber les particules et les cellules soumises au champ magnétique. Après compter, graine 2,5 fois 10 à la cinquième cellule CD8+T enrichie et mélange de particules magnétiques par 160 microlitres de milieu complété plus 1%TCGF dans une plaque à fond U de 96 puits.
Le troisième jour, nourrir les cellules avec 80 microlitres de milieu complété avec 2% de facteur de croissance des cellules T par puits et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre jours de plus. Le septième jour, récoltez les cellules stimulées dans un tube à fond rond de cinq millilitres pour compter et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille dans 0,5 millilitres de PBS complété par 0,05% d’azide de sodium et 2% de sérum bovin fœtal pour le comptage et aliquot cinq fois 10 à la quatrième à cinq fois 10 à la cinquième cellule dans de nouveaux tubes à fond rond de cinq millilitres pour la coloration spécifique aux antigènes.
Étiquetez les tubes appropriés avec du MHC-ig biotinylé et des CD8a anti-souris pendant une heure à quatre degrés Celsius, suivi d’un lavage centrifugeuse dans pbs frais pour enlever tout excès d’immunoglobuline biotinylée, puis tacher les échantillons avec un anticorps secondaire conjugué à la streptavidine appropriée et une souche appropriée de cellules mortes fixables vivant-mort pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et lire les cellules sur un cytomètre d’écoulement pour déterminer la spécificité et le nombre des cellules CD8+T spécifiques à l’antigène selon les protocoles standard. Ici, une conjugaison réussie de protéine a été réalisée utilisant trois méthodes différentes d’attachement de protéine aux particules. Si la densité ligand aAPC est trop faible, il n’y aura pas de stimulation efficace des cellules CD8+T spécifiques aux antigènes.
Le contrôle de la qualité du dimère biotinylated peut être complété sur les cellules transgéniques CD8+T pour vérifier la coloration. Par exemple, ces résultats représentatifs démontrent une coloration positive avec les cellules CD8+T spécifiques au gp100 avec des cellules B6 CD8+T non spécifiques aux antigènes comme contrôle d’arrière-plan. En outre, la connaissance de la coloration de fond du dimère biotinylated est critique, car n’importe quel pourcentage inférieur à cette coloration dans les tubes cognate-souillés devrait être considéré un résultat négatif.
Après sept jours d’enrichissement et d’expansion, entre deux fois 10 à la quatrième et deux fois 10 à la cinquième cellule CD8+T endogène et cinq à 50%CD8+T cellules peuvent être attendues à partir d’un original cinq fois 10 à la sixième endogène CD8 + T cellule de démarrage population. La même méthodologie peut être utilisée pour isoler et stimuler les cellules CD8+T spécifiques aux antigènes humains avec des augmentations similaires des pourcentages et des nombres de cellules CD8+T spécifiques aux antigènes observées après seulement une semaine d’expansion après enrichissement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer les contrôles de qualité de réaccente appropriés tels que décrits.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme la cytométrie de flux pour la coloration intracellulaire de cytokine ou l’expression de protéine de surface peuvent être exécutées pour répondre aux questions additionnelles au sujet de la fonctionnalité ou du phénotype des cellules. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie de base pour explorer l’étendue, la profondeur et la dynamique des réponses spécifiques aux antigènes dans d’autres domaines biomédicaux tels que le cancer, les maladies infectieuses ou la recherche sur l’auto-immunité.
