Les isolements des populations réelles de cellules d’inversion apoptotique a été un problème précédemment, qui limite considérablement notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ce protocole nous permet de générer une population plus pure de cellules d’inversion apoptotique. Le principal avantage de cette technique est que les matériaux et l’équipement utilisés sont largement disponibles dans différentes institutions.
Cette technique est facilement applicable pour isoler une population plus pure de cellules qui ont subi l’inversion de l’apoptose. Comme indiqué précédemment, les cellules normales peuvent également aller subir l’inversion d’apoptose, qu’en dehors des cellules cancéreuses du sein, différentes cellules de chimio, aussi bien que les cellules normales, peuvent être commencées et les divers stimulus apoptotiques peuvent être utilisés. Puisque la cellule d’inversion est passée par l’apoptose et le tri rapide, le taux de rétablissement est habituellement bas.
Un plus grand nombre de cellules de départ est recombinant pour augmenter le rendement final. Pour commencer, la culture MCF-7, MDA-MB-231, Pour commencer, la culture MCF-7, MDA-MB-231, et les cellules T47D, selon le protocole de texte. Après cela, laver les cellules avec PBS deux fois, puis ajouter deux millilitres de 0,05 pour cent trypsine-EDTA de 0,05 pour cent trypsine-EDTA à la MCF-7, et les cellules MDA-MB-231, aux cellules MCF-7, et MDA-MB-231, et deux millilitres de trypsine-EDTA de 0,25 pour cent et de deux millilitres de trypsine-EDTA de 0,25 pour cent aux cellules T47D.
aux cellules T47D. Culture des cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, dans un incubateur de culture de cellules de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Pendant que les cellules couvent, vérifiez le détachement des cellules à l’aide d’un microscope pour éviter la surdigestion par trypsine-EDTA.
Lorsque plus de 90 pour cent des cellules se détachent, ajouter cinq millilitres de milieu RPMI complété au plat, et pipette sur la surface de la couche cellulaire à plusieurs reprises. Ensuite, transférez les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres et une centrifugeuse. Jetez le supernatant et suspendez les granulés avec tampon FACS dans des tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ensuite, divisez les cellules en plusieurs tubes. Centrifuger les tubes une fois de plus, et jeter le supernatant. Ensuite, ajouter le bloc Fc dilué aux échantillons.
Incuber les échantillons sur la glace dans l’obscurité pendant 20 minutes, avant de les recouver à nouveau. Après cela, jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre les CD44 humains, et le CD24, contre le CD44 humain, et le CD24, dans un à 40, et un à dix dilutions, respectivement, aux groupes à double coloration.
Pour les contrôles positifs, ajouter des anticorps CD44 Pour les contrôles positifs, ajouter des anticorps CD44 aux cellules MDA-MB-231, aux cellules MDA-MB-231, et des anticorps CD24 aux cellules MCF-7 et aux anticorps CD24 aux cellules MCF-7 dans un à 40, et un à 10 dilutions, respectivement. Ajouter PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Ajouter PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, dilué à un rapport d’un à 40 par rapport aux cellules comme un contrôle isotopique pour les anticorps CD44. Ensuite, ajouter PE Mouse IgG2a Kappa, Puis, ajouter PE Mouse IgG2a Kappa, dilué à un rapport d’un à 10 pour les cellules comme un contrôle isotopique pour les anticorps CD24.
Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 300 g puis, centrifugez les échantillons à 300 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille deux fois dans 500 micro-litres de PBS.
Ensuite, répétez la centrifugation comme décrit précédemment. Suspendre à nouveau la pastille sur 0,5 millilitres de PBS et filtrer la suspension à l’aide d’un maillage en nylon de 40 micromètres. Ensuite, exécutez la suspension à travers un trieur de cellules activé par fluorescence.
Recueillir les cellules avec des marqueurs négatifs CD44, et CD24 marqueurs positifs dans les tubes à fond rond contenant un millilitre de milieu de collecte. Puis, centrifuger les tubes, et jeter le supernatant. Ensuite, plaquez les cellules cancéreuses non souches triées du sein dans un plat de culture contenant un milieu de collecte frais pour une culture plus douce.
Tout d’abord, utiliser une staurosporine millimolaire dans DMSO, Pour préparer 2,5 micro-molaires staurosporine en milieu, selon le protocole du texte. Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS une fois, après cela, ajouter 10 millilitres du milieu staurosporine aux cellules MSF-7 pendant six heures, pour induire l’apoptose, lorsque les cellules sont 70 pour cent confluent.
Ensuite, préparez un paclitaxel millimolaire dans DMSO. Ensuite, ajoutez 12,5 micro-litres Puis, ajoutez 12,5 micro-litres du paclitaxel de 1 millimolaire au milieu complété des cellules T47D pour faire un volume final de 10 millilitres dans un tube conique de 15 millilitres. Retirez le milieu de culture des cellules et lavez les cellules avec 2 millilitres de PBS.
Ensuite, ajouter le milieu paclitaxel aux cellules pendant 10 heures pour induire l’apoptose pendant 10 heures pour induire l’apoptose lorsque les cellules atteignent 70 pour cent de confluence. Après cela, retirez le milieu du groupe MCF-7 traité au solvant et lavez-le avec deux millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 10 millilitres de 0,25 pour cent DMSO moyen Puis, ajouter 10 millilitres de 0,25 pour cent DMSO moyen pendant six heures que le contrôle des solvants pour la staurosporine.
Retirez le milieu de culture du groupe T47D traité au solvant et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 10 millilitres de 0,05 pour cent DMSO moyen Puis, ajouter 10 millilitres de 0,05 pour cent DMSO moyen pendant 10 heures que le contrôle des solvants pour le paclitaxel. Ensuite, tacher la cellule et les incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent.
Utilisez un microscope à balayage laser 60 fois confocal pour observer les changements morphologiques des cellules traitées. Tacher à la fois l’inducteur apoptotique et les cellules MCF-7 et T47D traitées par solvant et les cellules MCF-7 et T47D traitées par solvant dans l’obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. À l’aide du trieur cellulaire activé par fluorescence, recueillir les cellules positives des groupes traités par l’inducteur dans des tubes de fond ronds contenant un millilitre de milieu de collecte.
Ensuite, centrifugez les tubes comme décrit précédemment, et jetez le supernatant. Recueillir les cellules négatives des groupes traités au solvant dans des tubes à fond rond avec un millilitre de milieu de collecte. Centrifuger les tubes, et jeter le supernatant.
Après cela, suspendre à nouveau les cellules triées dans le milieu de collecte frais. Ensemencer les cellules dans des plaques de culture tissulaire de 12 puits, et les culture pendant sept jours pour l’inversion de l’apoptose. Récoltez le MCF-7 inversé dans les groupes induits et traités par solvant avec 0,05 pour cent trypsine-EDTA.
avec 0,05 pour cent trypsin-EDTA. Puis, récolter les cellules T47D dans les deux inducteurs Puis, récolter les cellules T47D dans les deux groupes inducteurs et traités par solvant avec 0,25 pour cent trypsine-EDTA. Tacher les cellules avec des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre les CD44 et CD24 humains.
Tandis que les cellules tachent, préparez les contrôles d’isotype comme précédemment démontré. Enfin, exécutez les cellules sur un cytomètre d’écoulement, et détectez le pourcentage de cellules avec des marqueurs négatifs CD44 positifs et CD24. Dans ce protocole, la transition des cellules cancéreuses non souches du sein aux cellules sein csc-like a été observée.
L’isolement des cellules cancéreuses non souches a d’abord été fait dans les cellules MCF-7. Des changements morphologiques typiques ont été observés après ajout d’inducteurs apoptotiques, et les cellules se sont rétablies de l’apoptose avec la morphologie semblable après retrait de drogue. Les cellules activées par caspace ont été étiquetées et triées en fonction de leur intensité fluorescense plus élevée que les cellules sans activation de caspace.
Au cours du processus d’induction apoptotique, le solvant a été utilisé pour exclure la possibilité que la procédure des faits, ou le solvant lui-même, était la cause de la transition. Les cellules caspace-activées dans les groupes de traitement apoptotic-inducteur se sont trouvées pour être un nexin cinq positif et négatif de PI, suggérant qu’ils étaient des cellules apoptotiques. Les cellules apoptotiques ont été rassemblées et cultivés pour le rétablissement, comparées aux groupes solvant-traités, l’analyse cytométrique de flux a prouvé qu’il y avait des cellules apparaissant dans le quadrant positif de CD44 et cd24 négatif dans la population inversée à l’origine de cellules cancéreuses non souches de sein.
Le bâillonnement est important dans l’analyse du débit et le tri cellulaire, afin qu’un contrôle suffisant soit préparé dans les laboratoires. Puisque cette procédure in vitro d’inversion d’apoptose isole les cellules cancéreuses apoptotiques pures, des expériences telles que les actifs in vivo tumorigenesis peuvent être conduites pour comprendre les conséquences de l’inverse réel des cellules. Cette technique met en lumière la cause de la rechute du cancer, par conséquent, il peut être étudié pour potentiellement prévenir la ré-occurrence chez les patients atteints de cancer.
N’oubliez pas de vous protéger correctement lorsque vous effectuez des expériences de culture cellulaire conformément aux règlements de niveau biosécurité de votre établissement.
