Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la compréhension des changements d’expression génétique à travers des milliers de cellules individuelles après une blessure ou une maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de disséquer les transcriptomes des cellules individuelles dans un tissu complexe, et de mieux apprécier la dynamique fonctionnelle au sein d’une population donnée. L’avantage de notre protocole est qu’il fournit des méthodes complètes, de l’isolement des cellules individuelles dans les tissus primaires, à l’analyse et la visualisation de cet ensemble de données.
Bien que cette méthode commence à partir de suspensions unicelluliques de la peau et du nerf, les méthodes de séquençage que nous décrivons peuvent être appliquées pour étudier n’importe quel tissu mammifère. Elodie Labit et Wisoo Shin, deux stagiaires de mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Pour commencer, disséquer le nerf sciatique d’une souris euthanasiée en coupant d’abord la peau loin de la région postérieure de l’arrière de la souris.
Utilisez une lame stérile de scalpel pour faire une incision le long de la longueur de la cuisse. Ensuite, utilisez des forceps fins et des ciseaux pour exposer et enlever le nerf sciatique. Pour disséquer la peau dorsale du dos, utilisez des forceps fins et des ciseaux pour faire des incisions d’épaule en épaule, à travers la croupe, et dans le dos.
Lavez les tissus deux fois avec du HBSS glacé. Sous un microscope disséquant, enlever les tissus conjonctifs indésirables, les dépôts graisseux ou les débris. Pour la peau seulement, couper la peau en fines tranches, à l’aide d’une lame de scalpel stérile.
Pour obtenir le derme cutané, faire flotter les tranches de peau dans le dispase, dans HBSS dans un plat de 10 centimètres, pendant 30 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Utilisez des forceps fins pour peler et séparer l’épiderme du derme, puis jetez l’épiderme. Ensuite, pour la peau et les nerfs, utilisez une paire de lames de scalpel de stérilisation pour hacher chaque échantillon en un à deux millimètres.
Placez les morceaux de tissu en enzyme collagène froide fraîchement décongelée, deux grammes par millilitre de collagène froid-quatre dans un tube conique de 15 millilitres. Incuber chaque échantillon dans l’enzyme dans un bain de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec des secousses douces toutes les 10 minutes. À 30 minutes, utiliser un pipetter P1000 pour triturer le tissu 20 à 30 fois, et retourner au bain d’eau.
Répétez la trituration toutes les 30 minutes jusqu’à ce que la solution semble trouble et que des morceaux de tissu soient en grande partie dissociés. Pour la peau seulement, dans la dernière heure d’incubation, ajouter un milligramme par millilitre DNAse à l’échantillon de peau. Puisque certains types de cellules sont plus sensibles que d’autres au stress mécanique, les techniques de dissociation excessive peuvent biaiser votre population.
La dissociation générale est essentielle pour atteindre des rendements cellulaires élevés, et une représentation précise de la composition des tissus. Après cela, utilisez un filtre de 40 micromètres sur le dessus du tube conique de 50 millilitres pour filtrer chaque échantillon de tissu deux fois. Rincez le filtre avec un pour cent de BSA/HBSS.
Après avoir centrifugé les échantillons tels que décrits dans le manuscrit, suspendez à nouveau la pastille cellulaire dans HBSS, contenant un pour cent de BSA, à l’aide d’une pointe à alésage large, et placez-la sur la glace. L’ajout d’un colorant de viabilité vous aidera à optimiser votre préparation. Vous devez viser au moins 80 pour cent de cellules viables.
Une fois optimisées, cette étape et d’autres étapes de contrôle de la qualité peuvent être omises afin d’accélérer le processus de dissociation, ce qui permettra de mieux préserver la qualité de l’ARN et de réduire la perte cellulaire. Pour isoler les cellules viables et saines à l’aide du FACS, préparez d’abord des tubes à fond étroit de 15 millilitres avec huit millilitres de BSA/HBSS glacé pour les collections d’échantillons. Pour s’assurer que l’interface entre la surface du liquide et l’intérieur du tube est humide, et pour éviter la tension statique et de surface, inverser les tubes avant les collections.
Immédiatement après le tri cellulaire facs, une fois que les cellules sont recueillies dans un tube de 15 millilitres, utilisez un millilitre de un pour cent BSA / HBSS pour laver et pousser toutes les cellules vers le bas de la surface latérale du tube. Ensuite, centrifugeuse chaque échantillon à 260 g pendant huit minutes. Après avoir jeté le supernatant, suspendez la pastille cellulaire en un pour cent BSA/HBSS, et ajoutez 33,8 microlitres à un tube, et gardez ce tube sur la glace.
Cette étape est conçue pour être effectuée à l’aide de reagents obtenus à partir d’un kit normalisé. Toutes les étapes démontrées doivent être effectuées selon les instructions du fabricant. Pour se préparer à la génération GEM, placez une puce dans le porte-puce, préparez un mélange maître cellulaire sur la glace, selon le protocole du fabricant.
Ajouter 56,2 microlitres du mélange principal à un tube contenant 33,8 microlitres d’auto-suspension. Pour préparer la puce, d’abord à 50 pour cent de glycérol pour les puits qui ne seront pas utilisés. Ajouter ensuite 90 microlitres du mélange maître cellulaire au puits un, 40 microlitres de perles de gel au puits deux, et 270 microlitres d’huile de partitionnement au puits trois.
Couvrir la puce d’un joint. Pour charger la puce et exécuter dans un contrôleur à cellule unique, éjectez d’abord le plateau. Placez la puce dans le plateau.
Rétractez le plateau et appuyez sur jouer. Après la course complète, recueillir 100 microlitres de l’échantillon, et placer dans un tube PCR. Placez les tubes PCR dans une machine PCR prédéfinise, et exécutez selon le kit.
Après la course, les GEM incluront l’ADND à code à barres pleine longueur, provenant de l’ARNm polyadéthylé. Placez les tubes à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Procédez à la construction, au séquençage, à l’alignement et à l’analyse de la bibliothèque.
Une fois que les échantillons sont séquencés et alignés comme décrit dans le manuscrit, déposez les données sur un référentiel public, tel que GEO de NCBI. Pour ce faire, inscrivez-vous au compte de soumission. Tout d’abord, remplissez la soumission GEO en téléchargeant la feuille de métadonnées.
Assurez-vous d’inclure une seule feuille de métadonnées par soumission de projet. Placez la feuille de calcul dans l’annuaire. Deuxièmement, ajoutez le fichier de données brutes généré à partir du script de compte de garde-cellule pour toutes les bibliothèques dans l’annuaire.
Le troisième dossier est traité fichiers de données. Placez les fichiers de données traités générés à partir du script de compter des gardes cellulaires pour toutes les bibliothèques dans l’annuaire. Utilisez les informations d’identification du serveur FTP de l’auteur geo pour transférer l’annuaire contenant les trois composants.
Après l’exécution de Cell Ranger, les matrices de codes à barres génétiques prêtes à l’analyse peuvent être traitées à l’aide de bioinformatiques avancées. Premièrement, des vérifications quantitatives préalables au traitement ont été effectuées à l’aide de l’emballage Seurat R, qui a généré des parcelles de violon et de dispersion pour visualiser le nombre de gènes, le nombre d’identificateurs moléculaires uniques et le pourcentage de gènes mitochondriaux pour identifier les doublets cellulaires et les valeurs aberrantes. Pour la sélection des composants principaux, ou PC, des parcelles de coude ont été utilisées, dans lesquelles des PC au-delà du plateau de l’écart type de l’axe de PC, ont été exclus.
La résolution du regroupement a également été manipulée. La faible résolution a conduit à moins de clusters cellulaires, chaque cluster représentant probablement un type de cellule défini. La haute résolution a conduit à une probabilité cellulaire plus élevée, représentant des sous-types, ou états transitoires, d’une population cellulaire.
Les paramètres des grappes à basse résolution ont été utilisés pour une analyse plus approfondie des cartes thermiques d’expression afin d’identifier les gènes les plus fortement exprimés dans un cluster donné. Les gènes candidats individuels ont été visualisés sur des parcelles tSNE, à l’aide de la fonction d’intrigue caractéristique de Seurat, qui permettait de déchiffrer, s’il y avait des clusters qui représentaient, par exemple, des macrophages. Les deux groupes deux et quatre ont exprimé CD68, un marqueur pan-macrophage.
D’autres paquets fournissent également des outils pour le contrôle de la qualité, par exemple, Monocle, un ensemble R utilisé pour la construction de trajectoires cellulaires, élimine les cellules de mauvaise qualité, et assure que la distribution de l’ARNm dans toutes les cellules est normale, et est tombé entre les limites supérieure et inférieure. Des cellules simples ont ensuite été classifiées et comptées, utilisant des gènes connus de marqueur de lignée, et des cellules exprimant des marqueurs d’intérêt ont été assignées au type de cellule numéro un. Il a été déterminé que le type de cellule numéro un étaient des fibroblastes.
Cette population a été évaluée pour construire la trajectoire développementale des fibroblastes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la PCR quantitative, l’hybridation in situ, une chimie immuniste devraient être effectuées pour valider l’exactitude des résultats de votre expression génétique. Le séquençage de l’ARNm à cellules simples a maintenant ouvert la voie à des chercheurs dans de nombreux domaines différents afin d’explorer l’hétérogénéité cellule à cellule et d’identifier la dynamique fonctionnelle dans différents tissus pendant l’homéostasie, et comment ceux-ci peuvent changer après une blessure ou dans le développement d’une maladie.
