Nous sommes reconnaissants à Austin Ferro et Juao-Guilherme Rosa du laboratoire Cvetanovic pour leur aide dans le dépannage des dissections et dans l’extraction de l’ARN et la RTqPCR. Cette recherche est financée par M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).

1. Configuration
<ol><li>Rassemblez l’équipement nécessaire, y compris les ciseaux de décapitation, les pinces contondantes, les ciseaux à dissection, les ciseaux vasculaires, les microspatules, la matrice cérébrale de souris sagittale, les lames de rasoir, les embouts de pipet de 200 μL, la boîte de Pétri en verre, la glissière en verre et le seau à glace. Placez tout l’équipement sur un tampon absorbant.</li>
	<li>Placez la boîte de Pétri, la plaque de verre et la matrice cérébrale sur la glace.</li>
	<li>À l’aide d’une lame de rasoir à un angle perpendiculaire, couper environ 5 mm de la pointe d’une pointe de pipette de 200 μL. Cela rend la taille de l’ouverture à l’extrémité de la pointe d’environ 1 mm de large. Cela devrait suffire à frapper le DCN. Mais cela peut également être ajusté au besoin en fonction de la dissection. Ayez de nombreux conseils prêts pour un remplacement et un ajustement faciles.</li>
	<li>Étiqueter les tubes de microfuge de 1,5 mL avec identification animale et région cérébelleuse (quatre tubes par animal).</li>
	<li>Remplissez le récipient cryosécure avec de l’azote liquide pour flash geler les tissus après l’extraction.</li>
</ol>2. Extraction et dissection du cerveau
Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives des comités de soins aux animaux de l’Université du Minnesota.
<ol><li>Euthanasier la souris en utilisant une exposition au CO2 de 5%. Une fois que la respiration a cessé, effectuez une luxation cervicale. Décapitez la souris avec les ciseaux de décapitation et jetez la carcasse dans le récipient approprié.</li>
	<li>Faites une incision avec une lame de rasoir le long de la ligne sagittale médiale de la tête en commençant par le nez et en continuant jusqu’en arrière. Séparez la peau en la séparant de chaque côté de la ligne médiane. Utilisez la lame de rasoir pour couper le muscle de chaque côté, en coupant au-delà des conduits auditifs.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux disséquants, coupez toutes les régions de la moelle épinière, jusqu’à l’endroit où le tronc cérébral rencontre le cervelet, en prenant soin de ne pas endommager le cervelet.</li>
	<li>Insérez l’une des lames de ciseaux vasculaires dans l’espace entre le tronc cérébral et la colonne vertébrale et coupez vers le conduit auditif, en soulevant les ciseaux pour couper proprement l’os mais limiter les dommages aux tissus.</li>
	<li>Continuez à couper le long du bord du crâne vers les bulbes olfactifs, en continuant à soulever tout en coupant pour limiter les dommages au tissu cérébral.</li>
	<li>À l’aide de la pince émoussée, décollez doucement l’arrière du crâne en découvrant la région postérieure du cerveau et du cervelet.</li>
	<li>À l’aide de la pince émoussée le long du bord du crâne qui vient d’être coupé, pelez le reste du crâne vers le haut et sur le cerveau. Cette étape devrait enlever la majorité de la calotte crânienne, révélant le cerveau.</li>
	<li>Coupez le reste du crâne avec les ciseaux vasculaires et les pinces contondantes, en dégageant la majeure partie du crâne du haut du cerveau.</li>
	<li>À l’aide de la microsicule, soulevez légèrement le cerveau et enlevez et glissez vers le haut pour retirer les ampoules olfactives du crâne restant et déconnecter les fibres du tractus optique. Le cerveau devrait se libérer facilement à ce stade.</li>
	<li>Placez le cerveau dans la boîte de Pétri assis sur de la glace et retirez tout crâne restant ou d’autres débris.</li>
	<li>À l’aide du microspatule, placez doucement le cerveau dans la matrice cérébrale avec la face dorsale vers le haut. Prenez le temps de vous assurer qu’il est défini au niveau dans la matrice, en particulier que la ligne médiane tombe au centre de la matrice. Cette matrice est conçue pour le tissu cérébral de souris adultes, les tissus d’animaux plus jeunes ou malades peuvent reposer plus bas dans la matrice, mais il devrait toujours être possible d’obtenir des résultats reproductibles sur les échantillons.</li>
	<li>Placez une lame de rasoir le long de la ligne médiane sagittale, en vous assurant que la lame pousse jusqu’au bas de la matrice(Figure 1B).</li>
	<li>Placez une autre lame de rasoir de 1 mm sur le côté de la première lame(Figure 1B). Placez deux autres lames à 1 mm l’une de l’autre. Le résultat final devrait être trois lames placées d’un côté du cerveau, toutes espacées de 1 mm. Faites la même chose de l’autre côté. Au total, 7 pales seront placées à 1 mm l’une de l’autre(Figure 1C).</li>
	<li>Saisissez soigneusement les extrémités avant et arrière des lames de rasoir et soulevez-les directement hors de la matrice. Le tissu à l’extérieur des lames de rasoir peut être jeté.</li>
	<li>Lentement, séparez une lame de rasoir à la fois des autres, en veillant à ne pas endommager les sections de tissu.</li>
	<li>Faites glisser délicatement la section de tissu de la lame de rasoir et sur la lame de verre avec le microspatule. Au total, il y aura six sections cérébrales sagnitales(Figure 1D).</li>
	<li>Les 4 sections les plus latérales auront DCN visible (encadré violet, Figure 1D). Pour isoler le DCN, maintenez l’embout de pipette coupé de 200 μL perpendiculairement au-dessus du DCN et poussez fermement à travers le tissu, en se balançant dans toutes les directions pour disséquer complètement le DCN des tissus environnants. Soulevez tout droit pour retirer proprement le DCN et confirmez visuellement la présence du tissu dans la pointe.</li>
	<li>Placez un doigt en haut de la pointe et appuyez vers le bas, ce qui fait gonfler le tissu. Placez la pointe dans un tube de microfuge correctement étiqueté et assurez-vous que le poinçon de tissu est placé dans le fond du tube. Répétez 2.17 pour les trois sections restantes, en plaçant les poinçons DCN dans le même tube. Placez le tube dans de l’azote liquide pour geler. Représentation de la taille de chaque poinçon dans la Figure 1E.</li>
	<li>Les sections dont le DCN a été extrait sont considérées comme de l’hémisphère cérébelleux. Repoussez le reste du tissu cérébral autour du cervelet dans ces sections. Utilisez des pinces contondantes et ramassez doucement ces sections du cortex cérébelleux de l’hémisphère et placez-les dans le tube microfuge respectif. Gel du flash.</li>
	<li>Pour les deux dernières sections vermales (boîte bleu clair, Figure1D),repoussez le tissu cérébral environnant en ne laissant que le cervelet. À l’aide d’une lame de rasoir, faites une coupe séparant les lobules antérieurs des lobules postérieurs. La coupe doit être juste après la formation du lobule 6 et ne doit pas inclure le lobule 10(Figure 1F).</li>
	<li>À l’aide de pinces contondantes, placez soigneusement les sections du cortex cérébelleux antérieur et les sections postérieures du cortex cérébelleux dans leurs tubes de microfuge respectifs et gelez en laissant les tubes dans de l’azote liquide pendant 5 minutes. De là, passez à l’extraction de l’ARN, ou peut stocker les tubes à -80 ° C.</li>
</ol>3. Extraction de l’ARN 
REMARQUE: Ce protocole est modifié à partir du protocole Cold Spring Harbor pour l’extraction d’ARN avec TRIzol20. TRIzol solubilise le matériel biologique, ce qui permet d’extraire l’ARN.
<ol><li>Placez les tubes de microfuge dans de la glace pour empêcher le tissu de décongeler trop rapidement, appliquez 150 μL de TRIzol froid dans le tube de microfuge. Homogénéiser avec un pilon stérilisé. Une fois le tissu homogénéisé, pipetez la solution de haut en bas pour vous assurer qu’il n’y a pas de tissu restant intact. Briser davantage les petits morceaux de tissu en les tirant dans une seringue à insuline plusieurs fois.</li>
	<li>Ajouter encore 350 μL de TRIzol et pipet de haut en bas pour bien mélanger. Laisser reposer à température ambiante pendant 5 minutes.</li>
	<li>Ajouter 150 μL de chloroforme dans le tube et agiter vigoureusement, puis laisser reposer pendant 2-3 minutes. Le chloroforme sépare la solution tissulaire homogénéisée en phases (ARN, ADN et protéine).</li>
	<li>Centrifuger à 12 000 x g, à 15 °C, pendant 10 minutes. Assurez-vous que tous les tubes sont à la même orientation.</li>
	<li>Retirez soigneusement les tubes et réglez la température de la centrifugeuse à 4°C. Enlevez uniquement la phase aqueuse claire dans un nouveau tube (c’est l’ARN), en prenant soin de ne pas perturber l’interphase opaque (l’ADN).  La phase la plus basse sera rouge et contiendra des protéines. La solution restante dans les tubes peut être conservée ou jetée.</li>
	<li>Ajouter 100% d’alcool isopropylique à un rapport de 1:2 (si on enlève 200 ul de phase aqueuse, ajouter 100 μL d’alcool isopropylique). Bien mélanger en pipetant de haut en bas. Laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes. L’alcool isopropylique précipite l’ARN hors de la solution.</li>
	<li>Centrifuger à 12 000 x g, à 4 °C, pendant 10 minutes. Assurez-vous de placer tous les tubes à la même orientation pour faciliter la visualisation de la pastille. La pastille résultante sera l’ARN extrait.</li>
	<li>Retirez soigneusement les tubes, retirez le surnageant avec une pipette en veillant à ne pas perturber la pastille. La pastille ressemble un peu à du gel et sera difficile à voir, mais devrait pouvoir estimer où elle se trouve en fonction de l’orientation des tubes dans la centrifugeuse.</li>
	<li>Après avoir retiré tout le surnageant, ajouter 500 μL d’éthanol à 75%, vortex brièvement, et centrifuger à 7500 x g, à 4 °C, pendant 5 minutes. L’éthanol lave davantage le granulé.</li>
	<li>Retirez le surnageant avec précaution, sans perturber la pastille. Laissez les bouchons ouverts pour sécher l’échantillon. Cela prend généralement de 5 à 10 minutes, mais peut varier en fonction de la quantité d’éthanol restante sur le granulé. Ne pas trop sécher.</li>
	<li>Une fois sec, ressuspendez le granulé dans de l’eau sans DNase. Ajouter 20 μL aux échantillons pour le DCN et 30 μL pour tous les autres.</li>
	<li>Une fois réinsaisis, les échantillons peuvent être conservés à -80 °C ou procéder à d’autres tests.</li>
</ol>4. Réaction en chaîne quantitative par polymérase en temps réel (RTqPCR)
<ol><li>Avant cette étape, il sera nécessaire de traiter l’ARN par DNase pour éliminer tout ADN génomique et générer de l’ADNc en utilisant iScript de BioRad. Assurez-vous de normaliser la concentration d’ARN avant de fabriquer l’ADNc. De plus, il est important d’optimiser les amorces pour la qPCR. Suivez les méthodes décrites ici pour effectuer cette étape21. Brève description de la qPCR ci-dessous.</li>
	<li>Les amorces sont toutes achetées auprès d’IDT. Les séquences avant et arrière sont toutes deux dans le même tube d’échantillonnage et stockées à une concentration de 20x. Rps18 (gène témoin) : Avant – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Inverse – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumine (protéine de liaison au calcium, cellules inhibitrices): En avant – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Inverse – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (sous-unité du canal potassique): Avant – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' Inverse – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolase C (Zebrin II, exprimée différentiellement à travers le cortex cérébelleux) : Avant – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Inverse – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'</li>
	<li>Les conditions de la qPCR étaient les suivantes. Période de pré-incubation, 5 minutes, à 95°C. Période d’amplification, 50 cycles : 10 minutes à 95°C, 10 minutes à 62°C et 10 minutes à 72°C. Période de courbe de fusion, 5 secondes à 95 °C, une minute à 65 °C, et régler la vitesse de rampe à 0,07 °C/seconde jusqu’à la température cible de 97 °C. Puis période de refroidissement de 10 minutes à 40°C.  Toutes les réactions qPCR ont été réalisées en trois exemplaires et l’expression des gènes a été analysée en utilisant 2- ΔΔCt avec Rps18 comme contrôle de charge pour normaliser l’expression des gènes. L’extrait cérébelleux en vrac a été utilisé comme référence.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode décrite ici permet d’évaluer l’expression génique sous-jacente et les mécanismes moléculaires au sein de quatre régions cérébelleuses distinctes – les noyaux cérébelleux profonds (DCN), le cortex cérébelleux antérieur du vermis (CCaV), le cortex cérébelleux postérieur du vermis (CCpV) et le cortex cérébelleux des hémisphères (CCH). La capacité d’évaluer ces régions séparément élargira nos connaissances sur l’hétérogénéité de régions cérébelleuses spécifiques et peu...

Le cervelet contient plus de la moitié des neurones dans le cerveau et a toujours été appelé un centre de contrôle moteur et d’équilibre dans le cerveau1. Plus récemment, des études ont démontré que le cervelet joue un rôle clé dans diverses autres fonctions, y compris la cognition, le traitement de la récompense etl’affect2,3,4,5.
Le cervelet a une anatomie bien décrite: la région du cortex est composée de granules, de Purkinje et de couches moléculaires. Les cellules granulaires forment la couche cellulaire granulaire et envoient des entrées via des fibres parallèles aux dendrites cellulaires de Purkinje de la couche moléculaire qui reçoivent également l’entrée des fibres grimpantes provenant de l’olive inférieure. Les cellules de Purkinje envoient des projections inhibitrices aux cellules des noyaux cérébelleux profonds (DCN), qui servent de sortie principale du cervelet. La sortie de ce circuit cérébelleux est en outre modulée par l’activité des interneurones inhibiteurs dans le cortex cérébelleux, y compris les cellules de Golgi, stellaires etpaniers 4. Cette unité fonctionnelle cérébelleuse est répartie dans tous les lobules du cortex cérébelleux. Malgré ce circuit relativement uniforme à travers le cervelet, les preuves de la littérature de neuroimagerie humaine et des études de patients indiquent une hétérogénéité fonctionnelle du cervelet6,7.
Le cortex cérébelleux peut être divisé en deux régions principales: le vermis défini par la ligne médiane et les hémisphères latéraux. Le vermis peut être divisé en lobules antérieurs et postérieurs. Ces régions distinctes du cervelet ont été impliquées dans la contribution à différents comportements. Les modèles d’activité évoqués par une tâche ou sans tâche impliquaient que les régions antérieures du vermis contribuent davantage à la fonction motrice tandis que le vermis postérieur contribue davantage à la cognition6,7. Le vermis est également lié à l’affect et aux émotions, tandis que les hémisphères cérébelleux contribuent aux fonctions exécutives, visuelles-spatiales, langagiriques et autres fonctions mnémoniques8. En outre, des études anatomiques ont fourni des preuves que des régions cérébelleuses fonctionnellement distinctes sont liées à différentes régions corticales9. La cartographie des lésions-symptômes a révélé que les patients ayant subi un AVC affectant les lobules antérieurs (s’étendant jusqu’au lobule VI) avaient de moins bonnes performances sur les tâches motrices fines, tandis que les patients présentant des lésions des régions du lobe postérieur et des hémisphères présentaient des déficits cognitifs en l’absence de syndrome moteur cérébelleux10. Enfin, la pathologie cérébelleuse régionale dans la maladie indique que les régions cérébelleuses fonctionnellement distinctes sont également différemment sensibles à la maladie11,12.
Bien que beaucoup moins explorées, les preuves préliminaires démontrent des signatures d’expression génique distinctes dans les régions corticales cérébelleuses. L’expression cellulaire de Purkinje de Zebrin II montre un motif spécifique à la région dans le vermis tel qu’il y a plus de cellules positives de Zebrin II dans les lobules postérieurs et moins dans les lobules antérieurs13. Ceci est également en corrélation avec la fonction physiologique régionalement distincte car les cellules de Purkinje négatives de Zebrin II présentent une fréquence de déclenchement tonique plus élevée que les cellules de Purkinje qui sont Zebrin II positives14.
En plus du cortex cérébelleux, le cervelet comprend les noyaux cérébelleux profonds (DCN) qui servent de sortie primaire pour le cervelet. Les noyaux sont constitués des noyaux médiaux (MN), interposés (IN) et latéraux (LN). L’imagerie fonctionnelle et les études sur les patients ont démontré que le DCN participe également à divers comportements15, mais très peu d’études examinent le changement d’expression génique dans le DCN.
Les progrès des techniques moléculaires ont permis d’évaluer l’expression génique régionale dans le cerveau et ont révélé une hétérogénéité entre et au sein de différentes régions du cerveau dans les états physiologiques et pathologiques16. De telles études impliquent que le cervelet est différent des autres régions du cerveau. Par exemple, le rapport des neurones aux cellules gliales est inversé dans le cervelet par rapport à d’autres régions du cerveau1. Même dans des conditions physiologiques normales, l’expression des gènes pro-inflammatoires est régulée à la hausse dans le cervelet par rapport aux autres régions du cerveau17. Les techniques moléculaires ont également été très utiles pour identifier les voies qui contribuent à la pathogenèse des maladies cérébelleuses. Par exemple, le séquençage de l’ARN de l’ensemble des extraits cérébelleux a identifié des gènes modifiés dans un modèle murin transgénique spécifique à la cellule de Purkinje de l’ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) par rapport à leurs témoins de type sauvage. De telles preuves ont révélé des voies moléculaires clés sous-jacentes à la pathogenèse dans les cellules cérébelleuses de Purkinje et ont aidé à identifier des cibles thérapeutiques potentielles18. Cependant, des études récentes suggèrent qu’il existe des différences dans la vulnérabilité aux maladies dans les régions cérébelleuses11,12,19. Cela pourrait indiquer qu’il y a des changements clés qui se produisent dans des régions cérébelleuses distinctes, qui peuvent être masquées ou non détectées avec des extraits cérébelleux entiers. Il est donc nécessaire de développer des techniques qui permettent aux chercheurs d’examiner les profils moléculaires dans différentes régions cérébelleuses.
La technique proposée ici décrit une méthode reproductible pour disséquer quatre régions distinctes du cervelet de la souris afin d’isoler l’ARN de ces régions et d’explorer les différences régionales dans l’expression des gènes. Le schéma du cervelet de la souris sur la figure 1A met en évidence le vermis en bleu et les hémisphères en jaune. Concrètement, cette technique permet d’isoler quatre régions : les noyaux cérébelleux profonds (DCN) (cases pointillées rouges sur la figure 1A),le cortex cérébelleux du vermis antérieur (CCaV) (bleu foncé sur la figure 1A),le cortex cérébelleux du vermis postérieur (CCpV) (bleu clair sur la figure 1A),et le cortex cérébelleux des hémisphères (CCH) (jaune sur la figure 1A). En évaluant séparément l’expression génique de ces régions, il sera possible d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux fonctions discrètes de ces différentes régions ainsi que les différences potentielles dans leur vulnérabilité à la maladie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Le cervelet joue un rôle important dans plusieurs fonctions clés, notamment le contrôle du mouvement, de l’équilibre, de la cognition, de la récompense et de l’affect. Les études d’imagerie indiquent que des régions cérébelleuses distinctes contribuent à ces différentes fonctions. Les études moléculaires examinant les différences cérébelleuses régionales sont à la traîne car elles sont principalement effectuées sur des extraits cérébelleux entiers, masquant ainsi toute distinction entre des régions cérébelleuses spécifiques. Nous décrivons ici une technique permettant de disséquer de manière reproductible et rapide quatre régions cérébelleuses différentes : les noyaux cérébelleux profonds (DCN), le cortex cérébelleux vermal antérieur et postérieur et le cortex cérébelleux des hémisphères. La dissection de ces régions distinctes permet d’explorer les mécanismes moléculaires qui peuvent sous-tendre leurs contributions uniques à l’équilibre, au mouvement, à l’affect et à la cognition. Cette technique peut également être utilisée pour explorer les différences de susceptibilité pathologique de ces régions spécifiques à travers divers modèles de maladies de souris.

Pour ces expériences, quatre souris sauvages femelles de type C57/Black6 âgées de onze semaines ont été utilisées. Une souris a été utilisée pour effectuer une dissection cérébelleuse complète appelée « cervelet en vrac » et a permis de comparer les niveaux d’ARN dans les régions disséquées à une dissection complète. Les trois autres souris ont été utilisées pour effectuer la dissection cérébelleuse décrite dans ce protocole. L’utilisation de trois souris p...

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Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Différentes régions cérébelleuses ont été impliquées pour jouer un rôle dans des résultats comportementaux distincts, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Ce travail décrit une méthode pour disséquer de manière reproductible et rapide le cortex cérébelleux des hémisphères, les régions antérieures et postérieures du vermis et les noyaux cérébelleux profonds afin de sonder les différences moléculaires en isolant l’ARN et en testant les différences dans l’expression des gènes.

Dissection régionale cérébelleuse pour l’analyse moléculaire

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K vues.  University of Minnesota. Différentes régions cérébelleuses ont été impliquées pour jouer un rôle dans des résultats comportementaux distincts, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Ce travail décrit une méthode pour disséquer de manière reproductible et rapide le cortex cérébelleux des hémisphères, les régions antérieures et postérieures du vermis et les noyaux cérébelleux profonds afin de sonder les différences moléculaires en isolant l’ARN e...

Vidéo: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

Un simple système de notation composite phénotype pour l&#39;évaluation des modèles murins de l&#39;ataxie cérébelleuse

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...