En utilisant ce protocole, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique. La purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères par rapport à la purification in vitro conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus radiologiques. Commencez par ajouter 1,5 millilitre de milieu sérique réduit dans trois tubes centrifugés de 15 millilitres.
Ajouter de l’ADN plasmidique prêt pour la transfection dans chaque tube et ajouter 0,2 microgramme de plasmide de protéine fluorescente verte pour surveiller l’efficacité de la transfection. Ajouter 78 microlitres de réactif de transfection des liposomes à 4,5 millilitres de milieu sérique réduit dans un autre tube de centrifugation pour diluer les liposomes. Bien mélanger en agitant le tube, puis laisser reposer pendant cinq minutes à température ambiante.
Ajouter 1,5 millilitre de la solution de liposomes diluée dans chaque tube contenant 1,5 millilitre de la solution d’ADN diluée. Bien mélanger et réticuler les plasmides avec les liposomes pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Jetez le milieu d’origine des boîtes de Petri et ajoutez neuf millilitres du milieu sérum réduit dans chaque boîte.
Ajouter trois millilitres du mélange d’ADN liposomique et mélanger la solution en secouant doucement la plaque d’avant en arrière trois fois, puis à gauche et à droite trois fois pour une répartition uniforme du mélange sur la plaque. Culture des cellules dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Remplacez le milieu après quatre à six heures et continuez à cultiver les cellules pendant 24 à 36 heures.
Après 24 à 36 heures, traiter les cellules avec MG132 à une concentration finale de 10 micromolaires pendant quatre à six heures. Jetez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé. Ajouter un millilitre de PBS au plat.
Retirez les cellules en les grattant avec un racleur propre et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation. Centrifuger à 700 G pendant cinq minutes pour recueillir les pastilles de cellule. Ajouter 800 microlitres du tampon de lyse FLAG glacé complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase aux cellules de chaque tube.
Mélangez les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex ou d’un pistolet à pipette, puis incuber le mélange sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ultrasons le mélange sur la glace avec chaque impulsion d’une seconde et soumettez le mélange à cinq à 10 impulsions brèves. Incuber le mélange sur un rotateur à 40 RPM pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, centrifuger les échantillons ultrasoniques à 8 000 G pendant 20 à 30 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux. Aliquote 80 microlitres de la cellule extraire et mélanger avec 20 microlitres de tampon de chargement 5X SDS.
Faites bouillir les échantillons à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laisser refroidir sur la glace pendant deux minutes et conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Utilisez ces échantillons comme groupe d’entrée pour surveiller l’expression des protéines.
Ensuite, ajoutez 30 microlitres de billes conjuguées d’anticorps anti-FLAG M2 aux extraits cellulaires restants et incuber sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures ou toute la nuit. Centrifuger à 1 500 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les perles. Ajouter un millilitre du tampon de lyse FLAG glacé aux billes et mélanger en retournant le tube plusieurs fois.
Répétez cette étape quatre à six fois, puis ajoutez 40 microlitres des peptides FLAG à une concentration finale de 200 nanogrammes par microlitre aux billes. Incuber sur un rotateur pendant deux heures comme indiqué précédemment, puis centrifuger à la même température. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et ajouter 10 microlitres de tampon de chargement FDS 5X.
Faites bouillir le mélange à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-le sur de la glace pendant deux minutes. Ajouter un millilitre de PBS glacé aux granulés de la cellule et mélanger uniformément. Aliquote 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge comme échantillon d’entrée et centrifugation à 700 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les pastilles de cellule.
Ajoutez 80 microlitres de tampon de lyse FLAG à l’échantillon d’entrée et mélangez les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex comme indiqué précédemment. Lyser les cellules sur de la glace pendant une heure, puis centrifuger à nouveau pendant 20 à 30 minutes. Après centrifusion, aliquote 80 microlitres du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge et ajouter 20 microlitres de tampon de chargement 5X SDS au surnageant.
Faire bouillir le mélange à 98 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes, puis refroidir sur de la glace pendant deux minutes. Centrifuger les 900 microlitres restants de la suspension cellulaire à 700 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir la pastille de cellule. Ajouter un millilitre de tampon d’ubiquitine 1 aux granulés de cellules et mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois pour répartir les cellules uniformément.
Soumettre les lysats cellulaires à 10 à 20 cycles d’ultrasons sur glace jusqu’à ce que la solution ne soit plus visqueuse, puis centrifuger la solution. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajouter 30 microlitres de résine chargée de nickel au surnageant. Incuber sur un rotateur à 15 tr/min pendant quatre heures ou toute la nuit à température ambiante, puis centrifuger pendant deux minutes.
Après centrifusion, recueillir les billes et y ajouter un millilitre de tampon ubiquitine 1. Incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifuger à nouveau à 1 500 G pendant deux minutes, comme indiqué précédemment. Ajouter un millilitre de tampon ubiquitine 2 aux billes et effectuer l’incubation suivie d’une centrifugation, comme indiqué précédemment, pour recueillir les billes.
Répétez cette étape une fois. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS aux billes et suivez la même procédure d’incubation et de centrifugation pour recueillir les perles. Répétez cette étape une fois de plus.
Éluer les protéines liées en incubant les billes avec 40 microlitres d’imidazole à une concentration finale de 0,5 molaire pendant une heure à température ambiante. Après incubation, centrifuger à nouveau à 1 500 G pendant deux minutes. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre et ajouter 10 microlitres de tampon de chargement FDS 5X.
Faites bouillir la solution à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-la sur de la glace pendant deux minutes. Résoudre les échantillons par SDS-PAGE, puis les transférer sur une membrane de nitrocellulose par Western blot pour détecter les protéines cibles à l’aide des anticorps correspondants. Démarrez le système d’imagerie par chimiluminescence pour détecter les signaux du transfert Western.
Placez la membrane de nitrocellulose dans la camera obscura face vers le haut. Coder la solution de substrat uniformément sur la membrane à l’aide d’un pistolet à pipette. Enfin, sélectionnez la procédure d’exposition automatique pour capturer les signaux chimioluminescents et ajustez manuellement le temps d’exposition jusqu’à ce qu’un signal idéal soit acquis.
La protéine p53 totale, y compris la protéine p53 ubiquitinée, a été immunoprécipitée avec des billes FLAG M2 provenant de cellules H1299 dans des conditions non dénaturantes. L’éluat a été soumis à un Western blot avec des anticorps anti p53 et anti hémagglutinine ou avec des anticorps anti p53 et monoclonaux. Ici, les extraits ou les intrants de cellules brutes ont été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti p53 et anti MDM2.
Le signal de la protéine p53 ubiquitinée, qui apparaît sous la forme d’une bande étalée de faible à haut poids moléculaire, a été nettement augmenté lorsque MDM2 a été exprimé de manière ectopique dans ces cellules. Ce résultat suggère que la protéine p53 ubiquitinée a été efficacement purifiée à partir de cellules. Ensuite, les cellules ont été lysées dans des conditions de dénaturation.
Les protéines cellulaires ubiquitinées totales ont été tirées vers le bas avec de la résine chargée de nickel et ont ensuite été soumises à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti p53 et anti-hémagglutinine. La protéine p53 ubiquitinée a été détectée à l’aide d’un anticorps anti p53 et d’un anticorps anti-hémagglutinine. Ici, à la cellule brute, les extraits ou les intrants ont été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti p53 et anti MDM2.
Les résultats ont montré que le niveau total de protéines ubiquitinées était inchangé, mais que le niveau de protéine p53 ubiquitinée était considérablement augmenté après que MDM2 ait été surexprimé dans ces cellules. Cela indique que les protéines totales d’ubiquitine contenant p53 ubiquitinées ont été efficacement retirées des lysats cellulaires dans des conditions de dénaturation. Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas de traiter les cellules avec MG132 avant la collecte cellulaire et d’ultrasons les cellules correctement sur la glace pour la purification des protéines ubiquitinées.
