Ce protocole nous permet d’explorer facilement les caractéristiques épigénétiques de la maladie neurodégénérative. Le principal avantage de cette technique est qu’elle exploite la levure comme un système modèle, par rapport à d’autres modèles cellulaires et animaux de la maladie neurodégénérative, la levure est rapide et rentable. Cette technique nous permet de cartographier les changements épigénétiques qui surviennent dans les maladies neurodégénératives, ce qui peut conduire à de nouveaux marqueurs pour le diagnostic, ainsi que de nouvelles cibles pour la thérapie.
Cette méthode permet une étude plus approfondie du rôle des marques épigénétiques dans la maladie neurodégénérative et peut être modifiée pour l’évaluation des fibroblastes humains et des cellules souches pluripotentes induites. Cette méthode particulière contient un certain nombre de détails qui doivent être démontrés visuellement, tels que le chargement approprié de l’appareil de tache occidentale. Michel Fallah et Navin Rana, tous deux chercheurs de premier cycle au laboratoire Torrente, démontreront la procédure.
Commencez par réédifier la levure des stocks congelés de glycérol sur les plaques moyennes sélectives d’agar d’histidine 2%, pour une incubation de deux à trois jours à 30 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, inoculer la levure restreaked pour chaque modèle de sur-expression et contrôler en cinq millilitres de milieu liquide sélectif d’histidine. Complété par 2% raffinose à 30 degrés Celsius et 200 rotations par minute, pendant la nuit.
Le lendemain matin, cultiver 100 millilitres de culture liquide pour chacun des modèles de surexpression et les contrôles dans les médiums sélectifs complétés par 2% galactose pendant la nuit. Et mesurer la densité optique à 600 nanomètres ou OD600 pour déterminer le volume de la culture du jour au lendemain nécessaire pour rendre plus de cultures d’expression à un OD600 de départ de 0,3. Pour induire une surexpression des protéines, faire pousser la levure sur le milieu galactose avec des secousses à 30 degrés Celsius pour la période expérimentale appropriée.
Mesurez ensuite l’OD600 de chaque culture à la fin de la période d’induction. Et normaliser tous les nombres de cellules à la valeur OD600 la plus basse. Récoltez les cultures dans des tubes de centrifugeuse de 50 millilitres par centrifugation et réutilisez les granulés dans un millilitre d’eau calme stérile pour chaque 10 millilitres de culture cultivés.
Aliquot un millilitre de résuspension cellulaire dans les tubes individuels de microcentrifugeuse pour une centrifugation supplémentaire et aspirer les supernatants. Puis casser congeler les granulés cellulaires dans l’azote liquide pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour lyse les cellules pour l’analyse occidentale de tache, décongeler les granules de cellules de levure sur la glace avant la resuspension dans 100 microlitres d’eau distillée.
Ajouter 300 microlitres d’hydroxyde de sodium de 0,2 molaire et 20 microlitres de 2-Mercaptoéthanol à chaque échantillon cellulaire. Et resuspendez les granulés par pipetting. Après une incubation de 10 minutes sur la glace, pelleter les cellules par centrifugation et resuspendre les échantillons dans 100 microlitres de colorant de chargement.
Faire bouillir ensuite les échantillons pendant 10 minutes sur un bloc chauffant. Pendant que les échantillons sont lysés, placez deux gels dans un porte-gel et remplissez la chambre intérieure vers le haut avec tampon en cours d’exécution et la chambre extérieure à la marque de ligne de deux gels. Lorsque les échantillons sont prêts, chargez 15 microlitres chacun, solution de lyse cellulaire, dans chaque puits du puits 10, 12% gel polyacrylamide et ajouter cinq microlitres d’échelle de protéines à la voie échelle de protéines bien.
Faire fonctionner le gel pendant environ 45 minutes à 150 volts ou jusqu’à ce que le chargement du front de teinture atteigne le fond du gel. Pendant que le gel est en cours d’exécution, tremper deux tampons de fibres par gel dans le tampon de transfert et un fluorure de polyvinylidene, ou PVDF, membrane par gel dans le méthanol. Lorsque le gel est prêt, rincer la membrane dans le tampon de transfert et placer un tampon de fibre présoaked sur le fond d’une cellule d’appareil de transfert semi-sec.
Suivi de la membrane PVDF, le gel et le deuxième tampon de fibre présoaked. Réglez ensuite la puissance à 150 milliamps pendant une heure. À la fin du transfert de protéines, retirer la membrane de l’appareil de transfert pour un bref rinçage à l’eau distillée.
Placez la membrane rincée, côté protéine vers le haut dans une petite boîte à taches et couvrez la membrane avec de la solution saline ou tbs tamponnée par tris, bloquant le tampon pendant une incubation d’une heure à température ambiante avec un basculement doux. À la fin de l’incubation de blocage, incuber la membrane pendant la nuit avec un histone anti-levure et un anticorps spécifique à la modification dans le SCT à quatre degrés Celsius. Et un anticorps de contrôle de chargement nucléaire approprié.
Le lendemain matin, laver la membrane quatre fois dans le SCT, complété par 0,1% polysorbate 20 pendant cinq minutes avec basculement à température ambiante par lavage. Après le dernier lavage, incuber la tache avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante. Suivi de quatre lavages de cinq minutes au TBST et d’un lavage de cinq minutes dans le SCT seul avec bascule.
Puis l’image de la tache sur un système fluorescent d’imagination de tache occidentale pendant deux minutes. Ici, la suppression de croissance dans les cultures solides et liquides est montrée avec des effets significatifs sur la croissance de levure observés en présence de galactose-infusé dans les modèles de surexpression de sarcome. Une diminution significative des niveaux d’histone sont évidentes dans le modèle fusionné de surexpression de sarcome et des augmentations significatives des niveaux d’acétylation d’histone dans le modèle de surexpression de protéine de liaison de TAR 43, sont observées qui ne sont pas vues dans le modèle fusionné dans le sarcome ou l’exexpression alpha de synucléine.
Il y a également des diminutions significatives des niveaux d’histone dans le modèle de surexpression d’alpha synucléine. Dans cette expérience de sucrose-tuning, plus la quantité de galactose utilisée pour induire fusionné dans la surexpression de sarcome, la toxicité inférieure qui est observée dans la culture solide et liquide. Fait important, plus le niveau de fusion dans la surexpression du sarcome est faible, plus l’ampleur de la réduction des niveaux d’histone est faible.
Lors de l’exécution de ce protocole, il est impératif de normaliser la quantité de levure dans chaque échantillon pour permettre une comparaison appropriée dans les niveaux de modification post-translationnelle histone. 2-Mercaptoéthanol doit être utilisé sous un capot pour éviter l’inhalation. Si la tache Ponceau est utilisée, elle doit être jetée correctement.
