이 프로토콜은 우리가 쉽게 신경 퇴행성 질환의 후생 유전학 적 특징을 탐구 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효모를 모델 시스템으로 악용하여 신경 퇴행성 질환의 다른 세포 및 동물 모델에 비해 효모가 편리하고 비용 효율적이라는 것입니다. 이 기술은 우리가 진단을 위한 새로운 마커로 이끌어 낼 수 있는 신경 퇴행성 질병에서 생기는 후성 유전학 적인 변경, 뿐만 아니라 치료를 위한 새로운 표적으로 지도할 수 있습니다.
이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 후성 유전학 마크의 역할에 대한 추가 조사를 허용하고 인간의 섬유 아세포 및 유도 된 다능성 줄기 세포의 평가를 위해 수정 될 수있다. 이 특정 방법은 서양 블롯 장치의 적절한 하중과 같은 시각적으로 입증해야 하는 여러 가지 세부 사항을 포함합니다. 절차를 시연하는 것은 미셸 팔라와 나빈 라나, 토런트 실험실에서 두 학부 연구원이 될 것입니다.
먼저 냉동 글리세롤 주식에서 효모를 히스티딘 2%의 포도당 화고 선택형 중간 플레이트로 리스트하여 섭씨 30도에서 2~3일 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 히스티딘 선택적 액체 배지의 5밀리리터에서 각 오버 발현 모델에 대한 효모를 접종하고 제어한다. 섭씨 30도, 분당 200회전으로 하룻밤 사이에 2%의 라피노스를 보충합니다.
다음 날 아침, 각 과발현 모델에 대해 100밀리리터의 액체 배양을 키우고 하룻밤 사이에 2%의 갈라토스를 보충하는 선택적 매체의 제어기능을 제공합니다. 그리고 600 나노미터 또는 OD600의 광학 밀도를 측정하여 0.3의 시작 OD600에서 발현 배양을 통해 렌더링하는 데 필요한 야간 배양의 양을 결정한다. 단백질 과발현을 유도하기 위해, 적절한 실험 기간 동안 섭씨 30도에서 흔들면서 갈라토제 배지에서 효모를 자랍한다.
그런 다음 유도 기간이 끝날 때 각 배양의 OD600을 측정합니다. 그리고 모든 셀 수를 가장 낮은 OD600 값으로 표준화합니다. 원심분리로 50밀리리터 원심분리기 튜브에서 배양을 수확하고 재배된 10밀리리터당 1밀리리터의 멸균 스틸워터 1밀리리터로 펠릿을 재보냅니다.
Aliquot 1 밀리리터의 세포 재서스펜션을 개별 미세 원심 분리 튜브로 하여 추가 원심분리및 수퍼나티를 흡인시합니다. 그런 다음 스냅은 영하 80도에서 저장을 위해 액체 질소에 세포 펠릿을 동결. 서양 얼룩 분석을 위해 세포를 lyse하려면 증류수 100 마이크로 리터에서 재서스펜션하기 전에 얼음에 효모 세포 펠릿을 해동하십시오.
각 세포 샘플에 0.2-어금다 나트륨 수산화나트륨 300마이크로리터와 2-메르카포에탄올 20마이크로리터를 첨가합니다. 그리고 파이펫팅으로 펠릿을 다시 중단합니다. 얼음에 10 분 배양 후, 원심 분리에 의해 세포를 펠릿과 로딩 염료의 100 마이크로 리터에서 샘플을 다시 중단.
그런 다음 가열 블록에서 샘플을 10 분 동안 끓입니다. 샘플이 용해되는 동안, 젤 홀더에 두 개의 젤을 놓고 실행 버퍼와 외부 챔버를 두 젤 라인 마크에 내부 챔버를 채웁니다. 시료가 준비되면 각각 15 마이크로리터, 세포 용해용을 10웰, 12%폴리아크라이알라미드 젤의 각 우물에 적재하고 단백질 사다리 차선에 5마이크로리터를 잘 넣습니다.
젤을 150볼트에서 약 45분 간 또는 염색제 전면이 젤 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 젤이 실행되는 동안, 이송 버퍼에 젤 당 두 개의 섬유 패드와 메탄올에 젤 당 1 개의 폴리 비닐 리데인 불소 또는 PVDF를 담급니다. 젤이 준비되면, 전달 버퍼에 멤브레인을 헹구고 반건조 전달 장치 셀의 바닥에 1 개의 미리 침전 된 섬유 패드를 놓습니다.
PVDF 멤브레인, 젤 및 두 번째 미리 침전된 섬유 패드가 뒤따릅니다. 그런 다음 1시간 동안 150 밀리암페어로 전원을 설정합니다. 단백질 전달의 끝에서, 증류수로 짧은 헹구기 위해 전달 장치에서 멤브레인을 제거한다.
헹구린 멤브레인, 단백질 측면을 작은 염색 상자에 놓고 삼각형 버퍼식염수 또는 TBS로 멤브레인을 덮어 부드러운 흔들림으로 실온에서 1 시간 동안 배양 할 수있는 버퍼를 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 TBS에 있는 항효모 히스톤 및 수정 특정 항체로 밤새 멤브레인을 배양한다. 그리고 적절한 핵 적재 제어 항체.
다음날 아침, TBS에서 멤브레인을 4번 세척하고, 세탁당 실온에서 흔들리며 5분 동안 0.1%의 폴리소르바테 20으로 보충합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 1 시간 동안 적절한 이차 항체와 블롯을 배양. 그 다음에는 TBST에서 4분, 5분 세척, TBS에서만 5분간 세척할 수 있습니다.
그런 다음 형광 서양 블롯 상상 시스템에 2 분 동안 얼룩을 이미지합니다. 여기서, 고체 및 액체 배양에서의 성장 억제는 육종 과발현 모델에서 주입된 갈라토스의 존재하에서 관찰된 효모 성장에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 히스톤 레벨의 현저한 감소는 육종과발현 모델에서 명백하고 TAR 결합 단백질(43)의 히스톤 아세틸화 수준이 크게 증가하며, 육종 또는 알파 시뉴클레인 과발현 모델에서 융합된 것으로 볼 수 없는 것으로 관찰된다.
알파 시뉴클레인 과발현 모델에서 히스톤 레벨도 현저한 감소가 있다. 이러한 자당 튜닝 실험에서, 육종 과발현에서 융합을 유도하는 데 사용되는 갈라토스의 양이 낮을수록 고체 및 액체 배양 모두에서 관찰되는 독성이 낮다. 중요한 것은 육종 과발현에서 융합되는 수준이 낮을수록 히스톤 레벨의 감소 크기가 작아집니다.
이 프로토콜을 수행하는 동안 각 샘플에서 효모의 양을 표준화하여 번역 후 변형 후 수준에서 적절한 비교를 가능하게 합니다. 2-메르카포에탄올은 흡입을 피하기 위해 후드 아래에 사용해야합니다. Ponceau 얼룩을 사용하는 경우, 그것은 제대로 폐기해야합니다.
