Bu protokol nörodejeneratif hastalığın epigenetik özelliklerini kolayca keşfetmemizi sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir model sistemi olarak maya yararlanır, nörodejeneratif hastalık diğer hücresel ve hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında, maya uygun ve maliyet-etkin olmasıdır. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklarda ortaya çıkan epigenetik değişikliklerin haritasını çıkarmamıza olanak sağlar, bu da tanı için yeni belirteçlere yol açabilir, ayrıca tedavi için yeni hedefler.
Bu yöntem nörodejeneratif hastalık epigenetik işaretlerin rolünün daha fazla araştırılmasını sağlar ve insan fibroblastları ve indüklenen pluripotent kök hücrelerin değerlendirilmesi için değiştirilebilir. Bu özel yöntem, Batı leke aygıtının doğru yüklenmesi gibi görsel olarak gösterilmesi gereken bir dizi ayrıntı içerir. Prosedürü gösteren Michel Fallah ve Navin Rana, Torrente laboratuvarında her iki lisans araştırmacılar olacaktır.
30 santigrat derece bir iki ila üç günlük kuluçka için, histidin üzerine dondurulmuş gliserol stoklarında maya restreaking ile başlayın 2%glukoz agar seçici orta plakalar. Kuluçka sonunda, histidin seçici sıvı orta beş mililitre ifade modeli ve kontrolü üzerinde her biri için reoculate maya inoküle. Bir gecede 30 santigrat derecede %2 raffinose ve dakikada 200 dönüş le desteklenmiştir.
Ertesi sabah, bir gecede %2 galaktoz ile desteklenen seçici ortamlardaki aşırı ifade modelleri ve kontrollerinin her biri için 100 mililitre sıvı kültür yetiştirin. Ve optik yoğunluğu nu 600 nanometre veya OD600 olarak ölçün ve ifade kültürlerini 0,3'lük bir başlangıç OD600'de işlemek için gereken gece kültürünün hacmini belirleyin. Protein aşırı ekspresyonu neden etmek için, uygun deneysel zaman dilimi için 30 santigrat derece sallayarak galaktoz ortamda maya büyümek.
Daha sonra indüksiyon döneminin sonunda her kültürün OD600'ü ölçün. Ve tüm hücre sayımlarını en düşük OD600 değerine standartlaştırın. 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde kültürleri santrifüj le hasat edin ve yetiştirilen her 10 mililitre kültür için bir mililitre steril durgun suda peletleri yeniden askıya alın.
Aliquot ek bir santrifüj için bireysel mikrosantrifüj tüpler içine hücre resuspension bir mililitre ve supernatants aspire. Sonra eksi 80 santigrat derecede depolamak için sıvı nitrojen hücre peletleri snap dondurmak. Batı leke analizi için hücreleri lyse için, distile su 100 mikrolitre resuspension önce buz üzerinde maya hücre pelet çözülme.
Her hücre örneğine 300 mikrolitre 0,2 molar sodyum hidroksit ve 20 mikrolitre 2-Mercaptoetanol ekleyin. Ve boru lar ile peletleri yeniden askıya alın. Buz üzerinde 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, hücreleri santrifüj le peletleyin ve 100 mikrolitre yükleme boyasında numuneleri yeniden askıya alın.
Daha sonra bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca örnekleri kaynatın. Örnekler lysed edilirken, bir jel tutucu iki jel yerleştirin ve çalışan tampon ve iki jel çizgi işareti için dış oda ile üst iç oda doldurun. Numuneler hazır olduğunda, her biri 15 mikrolitre yükleyin, hücre lisis çözeltisi, 10 kuyunun her kuyusuna, %12 poliakrilamid jele ve protein merdiveni şeridine beş mikrolitre protein merdiveni ekleyin.
150 volt veya yükleme boya ön jel in altına ulaşana kadar yaklaşık 45 dakika boyunca jel çalıştırın. Jel çalışırken, transfer tampon ve bir poliviniliden florür jel başına jel başına iki fiber pedleri ıslatın, veya PVDF, metanol jel başına membran. Jel hazır olduğunda, aktarım tamponunda membranı durulayın ve yarı kuru transfer cihazı hücresinin altına önceden ıslatılmış bir fiber ped yerleştirin.
PVDF membran, jel ve ikinci önceden ıslatılmış fiber ped izledi. Sonra gücü bir saat liğine 150 miliampere ayarlayın. Protein transferinin sonunda, distile su ile kısa bir durulama için transfer cihazından membranı çıkarın.
Durulanmış membran, protein tarafı kadar küçük bir boyama kutusuna yerleştirin ve tris-tamponlu salin veya TBS ile membran kapağı, nazik sallanan oda sıcaklığında bir saat kuluçka için tampon engelleme. Engelleme kuluçka sonunda, bir anti-maya histon ve tbs modifikasyonözgü antikor ile bir gecede membran kuluçka dört derece santigrat. Ve uygun bir nükleer yükleme kontrol antikoru.
Ertesi sabah, tbs membran dört kez yıkayın, yıkama başına oda sıcaklığında sallanan ile beş dakika boyunca% 0.1 polisorbat 20 ile takviye. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlar ile leke kuluçka. Ardından TBST'de dört, beş dakika yıkar ve tbs'de sadece sallanan bir beş dakikalık yıkama.
Sonra iki dakika için bir floresan Batı leke hayal sistemi üzerinde leke görüntü. Burada, katı ve sıvı kültürlerde büyüme baskılanması sarkom aşırı ekspresyon modellerinde galaktoz infüzyon varlığında gözlenen maya büyüme üzerinde önemli etkileri ile gösterilmiştir. Sarkom overexpression modelinde erimiş histon düzeylerinde önemli bir azalma ve TAR bağlayıcı protein 43 overexpression modelinde histon asetilasyon düzeylerinde önemli artışlar görülmektedir, sarkom veya alfa sinüklein aşırı ekspresyon modelinde erimiş olarak görülmeyen ler görülmektedir.
Alfa sinüklein overexpression modelinde histon düzeylerinde de önemli düşüşler vardır. Bu sakaroz ayarı deneyinde, sarkom aşırı ekspresyonunda kaynaşmaya neden olmak için kullanılan galaktoz miktarı ne kadar düşükse, hem katı hem de sıvı kültürde görülen toksisite düşüktür. Daha da önemlisi, sarkom aşırı ekspresyonunda erimiş düzeyi ne kadar düşükse, histon düzeylerindeki azalmanın büyüklüğü de o kadar küçüktür.
Bu protokolü gerçekleştirirken, histon post-translation düzeylerinde uygun bir karşılaştırma sağlamak için her örnekteki maya miktarını standartlaştırmak zorunludur. 2-Mercaptoetanol teneffüs önlemek için bir başlık altında kullanılmalıdır. Ponceau lekesi kullanılırsa, düzgün bir şekilde atılmalıdır.
