このプロトコルは、神経変性疾患のエピジェネティックな特徴を容易に探求することを可能にする。この技術の主な利点は、酵母をモデルシステムとして利用し、神経変性疾患の他の細胞および動物モデルと比較して、酵母が便宜的かつコスト効率が良いということです。この技術は、診断のための新しいマーカーにつながる可能性のある神経変性疾患で生じるエピジェネティックな変化と、治療のための新しい標的をマッピングすることを可能にする。
この方法は、神経変性疾患におけるエピジェネティックマークの役割のさらなる調査を可能にし、ヒト線維芽細胞および誘導多能性幹細胞の評価のために改変することができる。この特定の方法には、ウェスタンブロット装置の適切なローディングなど、視覚的に実証する必要がある多くの詳細が含まれています。この手順のデモンストレーションは、トレント研究所の学部研究者であるミシェル・ファラとナヴィン・ラナです。
冷凍グリセロールストックからヒスチジン2%グルコース寒天選択的培地プレートに酵母を取り付け、摂氏30度で2〜3日間インキュベーションすることから始めます。インキュベーションの終了時に、各オーバー発現モデルに対して酵母を接種し、ヒスチジン選択的液体培地の5ミリリットルで制御する。摂氏30度で2%ラフィノース、毎分200回転、一晩で補います。
翌朝、一晩で2%ガラクトースを補充した選択的培地における過剰発現モデルおよび制御のそれぞれについて、100ミリリットルの液体培養液を成長させる。そして、600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定し、0.3の開始OD600で発現培養に必要な一晩の培養量を決定します。タンパク質の過剰発現を誘導するために、ガラクトース培地上で酵母を成長させ、適切な実験期間に摂氏30度で揺れる。
次に、誘導期間の終わりに各培養のOD600を測定する。そして、すべてのセルカウントを最小のOD600値に標準化します。遠心分離によって50ミリリットル遠心分離管で培養物を収穫し、成長した培養物の10ミリリットルごとに無菌スティル水の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。
アリコート1ミリリットルの細胞再懸濁液を個々のマイクロ遠心分離チューブに追加の遠心分離のために、上清を吸引する。その後、液体窒素中の細胞ペレットをマイナス80°Cで保存するためにスナップします。ウエスタンブロット分析のために細胞を解凍するには、蒸留水100マイクロリットルで再懸濁する前に、氷上の酵母細胞ペレットを解凍します。
各細胞サンプルに0.2モル水酸化ナトリウム300マイクロリットルと20マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを加えます。そして、ピペット処理によってペレットを再中断します。氷上で10分間のインキュベーションの後、遠心分離により細胞をペレット化し、100マイクロリットルの負荷染料でサンプルを再懸濁した。
その後、加熱ブロックで10分間サンプルを沸騰させます。サンプルが取り付けられている間、ゲルホルダーに2つのゲルを入れ、内側のチャンバーをランニングバッファで上部に、外側のチャンバーを2ゲルラインマークに充填します。サンプルの準備ができたら、それぞれ15マイクロリットル、細胞溶解溶液を10ウェルの各ウェルに12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、タンパク質ラダーレーンによくタンパク質ラダーの5マイクロリットルを追加します。
ゲルを約45分間150ボルトで実行するか、またはローディング染料前面がゲルの底部に達するまで実行します。ゲルが動いている間に、転写バッファーにゲルあたり2つの繊維パッドを浸し、1つのポリビニリデンフッ化物、またはPVDF、1ゲルあたりの膜をメタノールに浸します。ゲルが準備ができたら、膜を転写バッファーにすい、半乾燥転写装置の下部に1つのプリ浸し繊維パッドを置く。
その後PVDF膜、ゲル及び第2のプリ浸し繊維パッドが続く。その後、1時間150ミリアンペアに電力を設定します。タンパク質の移動の終了時に、蒸留水で短時間リンスするために、転写装置から膜を取り除く。
すすい膜、タンパク質側を小さな染色ボックスに置き、トリスバッファー付き生理食物またはTBSで膜を覆い、緩やかな揺れで室温で1時間のインキュベーションを阻止します。ブロッキングインキュベーションの終了時に、抗酵母ヒストンと改変特異的抗体を摂氏4度でTBSで一晩インキュベートします。そして、適切な核負荷制御抗体。
翌朝、膜をTBSで4回洗浄し、0.1%ポリソルベート20を5分間、洗浄ごとに室温で揺らします。最後の洗浄後、適当な二次抗体を室温で1時間インキュベートします。その後、TBSTで4分、5分間の洗浄、TBSだけで5分間の洗浄を行います。
その後、蛍光ウェスタンブロットイメージングシステム上のブロットを2分間イメージングします。ここで、固体および液体培養における成長抑制は、肉腫過剰発現モデルにおいてガラクトース注入された酵母の存在下で観察される酵母の増殖に有意な影響を与えることを示している。ヒストンレベルの有意な減少は肉腫過剰発現モデルにおける融合において明らかであり、また、TAR結合タンパク質43過剰発現モデルにおけるヒストンアセチル化のレベルの有意な増加は、肉腫またはαシヌクレイン過剰発現モデルのいずれにも見られないことが観察される。
αシヌクレイン過剰発現モデルのヒストンレベルにも有意な低下がある。本ショ糖チューニング実験では、肉腫過発現に融合を誘導するために用いられるガラクトースの量が少ないほど、固体培養液と液培養液の両方で観察される毒性が低くなる。重要なのは、肉腫過剰発現における融合のレベルが低いほど、ヒストンレベルの減少の大きさが小さくなる。
このプロトコルを実行している間、ヒストン翻訳後修飾のレベルで適切な比較を可能にするために、各サンプル中の酵母の量を標準化することが不可欠です。2-メルカプトエタノールは、吸入を避けるためにフードの下で使用する必要があります。ポンソー染色を使用する場合は、適切に廃棄する必要があります。
