Этот протокол позволяет нам легко исследовать эпигенетические особенности нейродегенеративных заболеваний. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует дрожжи в качестве образцовой системы, по сравнению с другими клеточными и животными моделями нейродегенеративных заболеваний, дрожжи являются целесообразными и экономически эффективными. Этот метод позволяет нам наметить эпигенетические изменения, которые возникают при нейродегенеративных заболеваниях, которые могут привести к новым маркерам для диагностики, а также новые цели для терапии.
Этот метод позволяет продолжить исследование роли эпигенетических знаков в нейродегенеративных заболеваниях и может быть модифицирован для оценки фибробластов человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Данный метод содержит ряд деталей, которые необходимо продемонстрировать визуально, таких как надлежащая загрузка западного аппарата помарки. Демонстрация процедуры будет Мишель Фаллах и Навин Рана, как студентов исследователей в лаборатории Торренте.
Начните с restreaking дрожжей из замороженных запасов глицерол на гистидин 2%глюкозы агар селективных средних пластин, в течение двух-трех дней инкубации при 30 градусов по Цельсию. В конце инкубации, привить restreaked дрожжей для каждого над моделью выражения и контроля в пяти миллилитров гистидина селективной жидкой среды. Дополняется 2%raffinose при 30 градусах по Цельсию и 200 оборотов в минуту, на ночь.
На следующее утро вырастите 100 миллилитров жидкой культуры для каждой из моделей переэкспрессии и элементы управления в селективных средах, дополненных 2%galactose ночью. И измерить оптическую плотность на 600 нанометров или OD600, чтобы определить объем ночной культуры, необходимой для визуализации над культурами выражения в начале OD600 из 0,3. Чтобы вызвать переэкспрессию белка, выращивайте дрожжи на галактозной среде при встряхивании при 30 градусах по Цельсию в течение соответствующего экспериментального периода времени.
Затем измерьте OD600 каждой культуры в конце индукционной периода. И стандартизируйте все значения ячейки до самого низкого значения OD600. Урожай культур в 50 миллилитровых центрифуг труб путем центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр стерильной еще воды на каждые 10 миллилитров культуры выросли.
Aliquot один миллилитр повторного деления клеток в отдельных микроцентрифуг трубки для дополнительной центрифугации и аспирировать супернатанты. Затем оснастки заморозить клеточные гранулы в жидком азоте для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы подлизать клетки для западного анализа помарки, оттепель дрожжевых клеток гранулы на льду до повторного незаменимия в 100 микролитров дистиллированной воды.
Добавьте 300 микролитров 0,2-молярного гидроксида натрия и 20 микролитров 2-меркаптоэтанола в каждый образец клетки. И перерасход гранул путем трубопроводов. После 10-минутной инкубации на льду, гранулы клеток центрифугации и повторного использования образцов в 100 микролитров погрузочного красителя.
Затем варить образцы в течение 10 минут на нагревательный блок. В то время как образцы в настоящее время lysed, поместите два геля в гель держатель и заполнить внутреннюю камеру на вершину с работает буфер и внешняя камера на два геля линии знака. Когда образцы будут готовы, загрузите по 15 микролитров каждый, раствор клеточного лиза, в каждую колодец из 10 хорошо, 12%полякриламидный гель и добавьте пять микролитров белковой лестницы в белковую лестницу хорошо.
Вы запустите гель в течение примерно 45 минут при 150 вольт или до загрузки красителя фронт достигает нижней части геля. В то время как гель работает, замочить два волокна колодки на гель в буфер передачи и один поливинидин фторид, или PVDF, мембрана на гель в метаноле. Когда гель будет готов, промыть мембрану в буфер передачи и поместите один presoaked волокна площадку на дне полусухой клетки переноса аппарата.
Затем мембрана PVDF, гель и второй presoaked волокна площадку. Затем установите мощность до 150 миллиампер в течение одного часа. В конце передачи белка удалите мембрану из переноса аппарата для краткого полоскания дистиллированной водой.
Поместите промытую мембрану, белок вверх в небольшой ящик для окрашивания и накройте мембрану трис-буферным солевым раствором или TBS, блокируя буфер в течение одного часа инкубации при комнатной температуре с нежным раскачиванием. В конце блокирующего инкубации инкубировать мембрану на ночь с антидрожожного гистона и модификации специфических антител в TBS при четырех градусах по Цельсию. И правильное антитело контроля ядерной нагрузки.
На следующее утро, мыть мембрану четыре раза в TBS, дополняется 0,1%полисорбат 20 в течение пяти минут с качания при комнатной температуре за стирку. После последней стирки инкубировать пятно с соответствующими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. Затем четыре, пять минут моет в TBST и одна пятиминутная стирка в TBS только с качания.
Затем изображение пятно на флуоресцентной западной помарки воображая системы в течение двух минут. Здесь подавление роста в твердых и жидких культурах показано со значительным влиянием на рост дрожжей наблюдается в присутствии галактозы проникнуты в саркомы переэкспрессии моделей. Значительное снижение уровня гистона проявляется в сплавленной в саркоме модели переэкспрессии и значительное увеличение уровней ацетилирования гистона в ТДО связывания белка 43 переэкспрессии модели, наблюдаются, которые не наблюдаются ни в сплавленных в саркоме или альфа-синуклеин оверэкспрессии модели.
Есть также значительное снижение уровня гистона в модели альфа-синуклеина переэкспрессии. В этом эксперименте по настройке сахарозы, чем меньше количество галактозы, используемой для индуцирования сплавленных в саркоме переэкспрессии, тем ниже токсичность, которая наблюдается как в твердой, так и в жидкой культуре. Важно отметить, что чем ниже уровень сливается в саркоме переэкспрессии, тем меньше величина снижения уровня гистона.
При выполнении этого протокола, крайне важно стандартизировать количество дрожжей в каждом образце, чтобы обеспечить надлежащее сравнение уровней гистон пост-трансляционной модификации. 2-Меркаптоэтанол следует использовать под капотом, чтобы избежать вдыхания. Если ponceau пятно используется, он должен быть отброшен должным образом.
