Ce protocole améliore considérablement le contraste entre les tissus de la plante parasite et de l’hôte dans les échantillons qui seront analysés par microtomographie. La technique décrite ici accélère le processus de perfusion de contraste à travers l’échantillon, permettant l’analyse de tissus et de structures spécifiques formés entre la plante parasite et l’hôte. L’approche du vide est très simple et ne devrait présenter aucune difficulté.
L’appareil de perfusion, en revanche, pourrait être un peu difficile à installer. Mais la pratique à l’avance pourrait aider. Pour les petits échantillons non ligneux, la méthode sous vide peut être utilisée pour l’application.
Attendu que la méthode de profusion devrait être utilisée pour les échantillons plus grands et ligneux, y compris un segment de la tige ou de la racine de l’hôte. Si vous utilisez la méthode du vide, placer l’échantillon dans le flacon contenant la solution contrastante. Ensuite, placez le flacon dans une chambre à vide ou un dessiccateur relié à une pompe à vide.
Retirez le couvercle du flacon et fermez la chambre à vide ou le dessiccateur. Vérifiez qu’il n’y a pas de fissures sur la chambre à vide ou le dessiccateur. Ouvrez la soupape d’échappement de la chambre ou du dessiccateur pour forcer l’air à sortir.
Allumez la pompe et attendez que la pression atteigne environ 20 pouces de mercure, ou 10 psi. Fermez la chambre ou la soupape d’échappement du dessiccateur pour empêcher l’air de rentrer. Ensuite, éteignez rapidement la pompe.
Laisser l’échantillon sous vide pendant au moins deux heures. Si vous utilisez la méthode de profusion, sélectionnez le réservoir d’alimentation en fonction de la taille de l’échantillon. Pour les petits échantillons, une seringue de 50 millilitres sans aiguille peut être utilisée comme réservoir.
Connectez une extrémité d’un tube en plastique transparent au réservoir d’alimentation. Ensuite, connectez l’autre extrémité à une vanne bidirectionnelle ou tridirectionnelle. Raccordez un deuxième tuyau à une autre sortie de la vanne.
Fixez le réservoir d’alimentation en position élevée sans démonter l’appareil installé à l’étape précédente. Fermez la vanne à trois ou deux voies pour empêcher le liquide de sortir du système de tuyauterie et versez la solution contrastante dans le réservoir d’alimentation. Assurez-vous qu’il n’y a pas de grosses bulles d’air dans le système de tuyauterie et refermez la vanne, en laissant l’appareil en place.
Pour préparer l’échantillon à la profusion de la solution de contraste, gardez-le immergé dans un liquide et coupez l’extrémité de l’extrémité proximale de la tige ou de la racine de l’hôte. Ouvrez soigneusement la vanne pour permettre à la solution contrastante de s’écouler lentement et remplissez le tube en plastique connecté au réservoir tout en maintenant l’extrémité ouverte du système dans une position légèrement surélevée pour empêcher la solution contrastante de se renverser. Connectez l’extrémité proximale de la tige ou de la racine hôte de l’échantillon à l’extrémité ouverte du système de tuyauterie.
Laisser la solution perfuser l’échantillon pendant au moins deux heures ou jusqu’à ce que la solution s’accumule à l’intérieur du récipient. Fermez la vanne et débranchez délicatement l’échantillon de l’appareil. Lavez l’échantillon en le plongeant dans l’eau pendant deux minutes.
Placez l’échantillon dans une serviette en papier à température ambiante pour permettre à l’excès d’eau de s’évaporer pendant deux à cinq minutes sans permettre à l’échantillon de sécher complètement. Enveloppez l’échantillon dans un film de paraffine et évitez de plier le film sur l’échantillon. Le micro-scanner peut être utilisé pour mieux comprendre les structures complexes des plantes parasites et leur interaction avec les hôtes de manière tridimensionnelle non destructive.
Les protocoles décrits ici fonctionnent pour différents systèmes micro-CT. Toutefois, les paramètres dépendent du système et des échantillons. Les images au microscope X 3D étaient aussi efficaces que les coupes anatomiques observées au microscope optique pour analyser l’organisation tissulaire et la topologie à l’interface hôte-parasite.
Sur la base de la différence de couleur blanc brillant et gris foncé due à l’absorption différentielle de la solution de contraste, il est possible d’observer l’abondance du parenchyme entourant le noyau vasculaire de l’haustorium. Le noyau vasculaire est facilement observé en coupes transversales car deux brins vasculaires sont séparés par un parenchyme. L’endoparasite Viscum minimum, se développant à l’intérieur d’une plante hôte succulente, a montré des cellules de parenchyme qui stockent les glucides sous forme d’amidon.
La différence d’absorption de l’iode a permis la détection du réseau complexe de brins corticaux formés par l’endoparasite dans le corps hôte. Les résultats obtenus pour Cuscuta Americana et Struthantus marcianus aident à illustrer la commodité de l’approche microtomographie pour les échantillons de petite et de grande taille, respectivement. La section virtuelle en série du champignon Sibelium a montré que les vaisseaux de la racine hôte bifurquent en tubercule parasitaire et que la continuité du xylème entre les deux plantes est formée par une connexion vaisseau à vaisseau via des plaques de perforation.
La procédure décrite ici peut être combinée avec d’autres techniques, telles que la segmentation virtuelle, pour fournir de nouvelles informations sur la structure tridimensionnelle de la connexion entre les plantes parasites et leurs hôtes. Cette technique a ouvert la voie à l’analyse de différents aspects de la biologie des plantes parasites, y compris le développement d’endoparasites et la fonctionnalité des connexions hyperparasitaires.
