L’obtention de quantités suffisantes de protéines membranaires pour des applications en aval reste un défi technique important. Ce protocole permet la purification de plusieurs protéines de transport membranaire à l’homogénéité. Un avantage clé de cette technique est que Saccharomyces cerevisiae est un système d’expression eucaryotique rentable et rentable pour les protéines membranaires qui permet l’optimisation de nombreuses variables expérimentales clés.
Commencez par inoculer trois colonies de levures transformées, en 50 millilitres de milieu sélectif supplémentaire complet sans histidine. Complété par une base d’azote de levure et 2% de glucose pour une incubation d’une nuit à 190 rotations par minute et 30 degrés Celsius. Supprimez la culture le lendemain.
Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique à 600 nanomètres ou OD 600. Et inoculer chacun des quatre flacons de deux litres contenant 500 millilitres de milieu de culture à un OD 600 de 0,01. Puis secouer les cultures à 190 rotations par minute à 30 degrés Celsius pendant 30 heures pour permettre aux cellules de consommer tout le glucose et de croître à une forte densité.
Pour induire l’expression du transporteur de borate, ajouter 125 millilitres de cinq x teneur en peptone de levure moyenne, complétée par 10% galactose à 190 rotations par minute à 30 degrés Celsius pendant 16 heures. Ensuite, récoltez les cellules de levure par centrifugation et réutilisez la pastille dans 100 millilitres d’eau froide. Tourbillonnez dans le vortex pour résuspendre la pastille de levure et transférer en série la solution pour ce faire avec toutes les bouteilles contenant des granulés.
Pour récolter les membranes de levure, tout d’abord, ajouter 11,25 millilitres d’une molaire Tris, 0,45 millilitres de 0,5 molaire EDTA et 2,25 millilitres de PMSF 100 millimolaires aux cellules résuspendues. Ajouter de l’eau à un volume final de 225 millilitres et transférer les cellules dans une boîte de frappe en métal de 450 millilitres. Garnir le volume restant de perles de verre froides de 0,5 millimètre et assembler la chambre perlée avec un rotor.
Plongez la chambre dans un bain de glace et effectuez six impulsions d’une minute, séparées par des périodes de repos de deux minutes pour éviter la surchauffe du lysate. Après la dernière impulsion, retirer la membrane de filtration d’un filtre en plastique jetable sur le dessus de la bouteille vissé dans une bouteille en verre et verser le contenu de la chambre perlée sur l’assemblage tout en appliquant le vide. Rincez ensuite avec le tampon de lavage de perles x en ajoutant à la chambre tourbillonnant, puis en ajoutant aux perles.
Rincer la chambre perlée avec 225 millilitres de tampon de lavage et laver les perles avec le contenu de la chambre. Recueillir le lysate par centrifugation et décanter le supernatant dans des bouteilles en polycarbonate pour l’ultracentrifugation pour la collecte des membranes. À la fin de l’ultracentrifugation jeter le supernatant et peser les bouteilles avec les granulés membranaires avant de résuspendre les membranes dans environ 35 millilitres de tampon de resuspension membranaire.
Ajouter les suspensions à un douncer en verre, puis Dounce homogénéiser les membranes un aliquot l’homogénéité dans un tube conique de 50 millilitres pour un stockage négatif de 80 degrés Celsius. Pesez les bouteilles de centrifugeuses vides pour déterminer la masse des membranes récoltées. Pour la solubilisation et la purification des protéines, ajouter une barre d’agitation et 150 milligrammes de DDM par gramme de membrane à un bécher sur la glace et resuspendre les membranes décongelées à un volume final de 15 millilitres de tampon de resuspension membranaire, complété par un MILLIMOLAR PMSF et 20 imidazoles millimolaires par gramme de membrane.
Ajouter la solution membranaire au bécher pendant une heure en remuant dans un bain de glace. Suivi d’une centrifugation pour granuler le matériau non solubilisé. Dans une pièce froide de 4 degrés Celsius, filtrer le supernatant à travers un filtre à seringues de cinq micromètres et utiliser une pompe périssaltique réglée à un débit d’un millilitre par minute pour charger l’échantillon sur une colonne d’affinité de nickel immobilisée d’un millilitre Puis, laver la colonne avec 10 volumes de colonne de tampon de lavage et diluer la protéine dans un tampon d’élitution.
Collecte de l’élitate en dix fractions d’un millilitre. Exécutez les fractions de gel préparées recueillies sur un gel de quatre à 20 % de la page Tris-Glycine SDS ainsi que des fractions de lysate et de lavage solubilisées à température ambiante, tirant le pic recueilli fractions échappées pour la concentration à un 500 micro litres ou moins de volume dans un concentrateur de coupure dalton de 50 kilos dans une centrifugeuse benchtop à quatre degrés Celsius. Filtrer la protéine concentrée à l’aide d’un filtre à colonne de spin de 0,2 micromètre et injecter le filtrate sur une colonne d’exclusion de taille équilibrée dans un tampon S-200.
Après avoir couru les fractions de pointe sur un deuxième gel de quatre à 20%Tris-Glycine SDS page, tacher le gel et de recueillir les fractions de pointe pur pour la concentration dans un concentrateur de coupure Dalton 50 kilo à quatre degrés Celsius comme vient de le démontrer. Ensuite, mesurez l’absorption de l’échantillon de protéines à une longueur d’onde de 280 nanomètres pour déterminer la concentration avant de stocker l’échantillon indéfiniment à 80 degrés Celsius négatifs. Pour effectuer un test de liaison croisée au glutaraldehyde, tout d’abord, ajoutez 0,5 milligramme par millilitre de protéines décongelées dans trois microlitres de tampon S-200 à cinq microlitres de tampon S200.
Complétez la réaction de contrôle négative avec l’ajout d’un microlitre de sulfate de dodecyl de 20 % et d’un microlitre de 1,5 % de glutaraldehyde. Compléter les échantillons expérimentaux avec l’ajout d’un micro litre d’eau et d’un micro litre de glutaraldehyde de 1,5%. Après 30 minutes à température ambiante mettre fin à la réaction avec cinq microlitres de 3x SDS page gel charge die contenant un excès de tampon Tris pour étancher le glutaraldehyde et charger les 15 micro litres de la solution sur un gel de quatre à 20%Tris-Glycine SDS page.
Ensuite, faire fonctionner le gel à 200 volts pendant 30 minutes avant de tacher pour déterminer l’étendue de la liaison croisée dimer comme en témoigne une bande qui fonctionne à deux fois la taille du monomère dénaturé. Tachez le gel en secouant sur un shaker orbital lent avec la tache de gel ajoutée au gel. Ici, les gels typiques pour les fractions échappées de la chromatographie d’affinité de nickel montrent trois protéines partiellement purifiées avec les fractions de lysate ne démontrant pas une bande significative correspondant au transporteur de borate comme prévu pour les protéines qui n’expriment pas trop bien.
La voie de lavage millimolaire ad dans chaque gel montre une perte minimale des dix protéines étiquetées histidine malgré leur concentration relativement élevée d’émetteurs anciens. Bien que les bandes correspondant aux transporteurs de borate soient facilement apparentes dans les fractions échappées. Avant l’injection de la colonne S200, les protéines ne sont pas suffisamment purifiées pour de nombreuses applications en aval, comme l’indiquent les bandes supplémentaires de chaque échantillon.
Après leur injection dans les colonnes d’exclusion de taille cependant, des fractions échappées d’une pureté élevée peuvent être observées. Le croisement démontre que les transporteurs homomériques purifiés pourraient voir leur assemblage en solution facilement évalué avec l’étendue des liaisons croisées dépendant du nombre de résidus de lysine à proximité les uns des autres Il est important de se rappeler qu’une fois que la récolte cellulaire commence, la protéine doit être maintenue au froid en tout temps. Soit sur la glace dans une pièce de quatre degrés Celsius ou dans un étui de charcuterie.
Après cette procédure, les protéines membranaires peuvent être davantage caractérisées par des méthodes biophysiques, biochimiques ou structurelles, y compris la cristallographie aux rayons X ou la microscopie cryo-électronique. En permettant la purification de quantités milligrammes de protéines homogènes, ces techniques ont été utilisées pour déterminer la structure cristalline de l’Arabidopsis thaliana un transporteur.
