다운스트림 응용 을 위한 막 단백질의 충분 한 양을 얻는 것은 중요 한 기술적 인 도전 남아. 이 프로토콜은 균일성에 여러 멤브레인 수송 단백질의 정제를 가능하게합니다. 이 기술의 주요 장점은 Saccharomyces cerevisiae는 많은 주요 실험 변수의 최적화를 허용하는 막 단백질을 위한 시간 및 비용 효과적인 진핵 발현 시스템이라는 것입니다.
히스티딘없이 완전한 보충 선택적 매체의 50 밀리리터에서, 세 변형 효모 식민지를 접종하여 시작합니다. 효모 질소 베이스와 2 %의 포도당을 분당 190 회전과 섭씨 30도에서 하룻밤 배양시 보충합니다. 다음 날 문화권에서 제거합니다.
분광계를 사용하여 600 나노미터 또는 OD 600의 광학 밀도를 결정합니다. 그리고 배양 배지 500밀리리터를 함유한 4개의 2리터 플라스크를 각각 0.01의 OD 600에 접종한다. 그런 다음 세포가 모든 포도당을 소비하고 고밀도로 성장할 수 있도록 30 시간 동안 섭씨 30도에서 분당 190 회전에서 배양을 흔들어.
붕산 수송식을 유도하려면 5 x 효모 펩톤 배지의 125 밀리리터를 넣고 16시간 동안 섭씨 30도에서 분당 190회전에서 10%의 갈라토를 첨가합니다. 그런 다음 원심 분리에 의해 효모 세포를 수확하고 차가운 물의 100 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 소용돌이에서 소용돌이하여 효모 펠릿을 재일시 중단하고 펠릿을 포함하는 모든 병으로 이 작업을 수행하도록 솔루션을 일련 적으로 전달합니다.
효모 막을 수확하려면 먼저, 1개의 어금니 트리의 11.25 밀리리터, 0.45 밀리리터 0.5 개의 어금니 EDTA 및 2.25 밀리리터의 100 밀리머 PMSF를 회수 된 세포에 추가하십시오. 225 밀리리터의 최종 부피에 물을 추가하고 450 밀리리터 금속 비드 구타 캐니스터로 세포를 전송합니다. 차가운 0.5 밀리미터 유리 구슬로 남은 부피를 위로 하고 비드 구슬 챔버를 로터로 조립합니다.
얼음 욕조에 챔버를 침지하고 lysate의 과열을 방지하기 위해 2 분 휴식 기간에 의해 분리 여섯 1 분 펄스를 수행합니다. 마지막 펄스 후, 유리 병에 나사 플라스틱 일회용 병 상단 필터에서 여과 막을 제거하고 진공을 적용하는 동안 조립에 구슬 구슬 챔버의 내용을 부어. 그런 다음 챔버 소용돌이에 추가 한 다음 구슬에 추가하여 두 개의 x 비드 워시 버퍼로 헹구십시오.
225 밀리리터의 세척 버퍼로 비드 구슬 챔버를 헹구고 구슬을 챔버의 내용물로 씻습니다. 원심분리에 의해 용액을 수집하고 멤브레인 의 수집을위한 초원심 심립화를위해 폴리 카보네이트 병에 상류제를 데칭. 초원심분리의 끝에서 상체를 버리고 멤브레인 환액 버퍼의 약 35 밀리리터에서 멤브레인을 다시 중단하기 전에 멤브레인 펠릿으로 병을 무게.
유리 Douncer에 현탁액을 추가 한 다음 음수 80섭씨 저장을 위해 50 밀리리터 원컬 튜브에 균일 한 알리코산의 알리코트 인 막을 균질화합니다. 빈 원심분리기 병을 계량하여 수확된 멤브레인의 질량을 결정합니다. 단백질 용해화 및 정제를 위해, 얼음에 비커에 멤브레인 그램 당 DDM의 150 밀리그램을 추가하고 15 밀리리터의 멤브레인 재서스펜션 버퍼의 최종 부피에 해동 된 멤브레인을 다시 일시 중단, 하나의 밀리머 PMSF와 20 밀리머 리미다졸 의 그램 의 음막.
얼음 욕조에서 1 시간 동안 비커에 멤브레인 용액을 추가하십시오. 이어서 비용윤성 물질을 펠릿화하는 원심분리가 뒤따랐다. 섭씨 4도의 콜드룸에서 5마이크로미터 주사기 필터를 통해 상피를 걸러내고 분당 1밀리리터의 유량으로 설정된 연동 펌프를 사용하여 샘플을 1밀리리터 고정 니켈 선호도 컬럼에 로드한 다음, 10컬럼의 세척 버퍼로 컬럼을 세척하고 단백질을 희석시 희석시 사용합니다.
10 밀리리터 분획에서 용루를 수집합니다. 수집된 준비된 젤 분획을 4~20%의 Tris-Glycine SDS 페이지 젤에 수용형 lysate 및 wash 분수와 함께 실행하여, 4도의 벤치원심근에서 50kg 달튼 컷오프 농축기로 농도가 500 마이크로 리터 이하의 농도로 수집된 피울을 뽑아냅니다. 0.2 마이크로미터 스핀 컬럼 필터를 통해 농축 된 단백질을 필터링하고 S-200 버퍼에서 평형된 크기 배제 컬럼에 여과물을 주입합니다.
4~20%의 트리스-글리신 SDS 페이지 젤에서 피크 분획을 실행한 후, 젤을 염색하고 50킬톤 컷오프 농축기에서 농도를 위한 순수한 피크 분획을 4°C에서 4도에서 수집하였다. 그런 다음 280 나노미터 파장에서 단백질 샘플의 흡광도를 측정하여 샘플을 음수 80°C로 무기한 저장하기 전에 농도를 결정합니다. 글루타랄데히드 교차 연결 분석서를 수행하려면 먼저 S-200 버퍼 의 3 개의 마이크로 리터에 해동 단백질 밀리리터 당 0.5 밀리그램을 S200 버퍼의 5 마이크로 리터에 추가하십시오.
20%의 소문자리터 1개, 1.5%의 글루타랄데히드 1편을 첨가하여 음성 대조반응을 완료한다. 1 마이크로 리터의 물과 1.5 %의 글루타랄데히드 1 마이크로 리터를 추가하여 실험 샘플을 완료하십시오. 실온에서 30분 후 3x SDS 페이지의 젤 로딩 다이 5개 마이크로리터로 글루타랄데히드를 담금질하고 용액 의 15마이크로 리터를 4~20% 트리스-글리신 SDS 페이지 젤에 적재한다.
이어서, 염색하기 전에 30분 동안 200볼트에서 젤을 실행하여 변성 단조량의 두 배 크기로 실행되는 밴드에 의해 입증된 대로 디머 크로스 링크의 정도를 결정한다. 젤 얼룩이 첨가된 느린 궤도 셰이커에 흔들어 젤을 얼룩지게 합니다. 여기서 니켈 친화성 크로마토그래피로부터 의 피각된 분획에 대한 전형적인 젤은 용해 분획을 가진 3개의 부분적으로 정제된 단백질을 나타내며, 이는 보다 과다하게 표현되지 않는 단백질에 대해 예상대로 붕산 수송기에 대응하는 중요한 밴드를 보여주지 않는다.
각 젤의 광고 밀리몰러 워시 레인은 상대적으로 높은 방출기 의 오래된 농도에도 불구하고 10히스티딘 태그 단백질의 최소 손실을 보여줍니다. 붕산 운송업자에 대응하는 밴드는 피각된 분수에서 쉽게 드러나지만. S200 컬럼 주입 전에, 단백질은 각 샘플의 추가 밴드에 의해 표시된 바와 같이 많은 다운스트림 응용 프로그램에 대해 충분히 정제된다.
그러나 크기 배제 컬럼에 주입한 후, 고순도의 분획을 관찰할 수 있다. 크로스 링크는 정제 된 동종 수송기가 서로 근접하여 리신 잔류물의 수에 의존하는 교차 연결의 정도로 쉽게 평가 용액에서 자신의 조립을 가질 수 있음을 보여줍니다 세포 수확이 시작되면, 단백질은 항상 차가운 유지해야한다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 섭씨 4도의 방이나 델리 케이스의 얼음 위에 있습니다.
이 절차에 따라 막 단백질은 X 선 결정학 또는 극저온 현미경 검사법을 포함한 생체 물리학, 생화학 적 또는 구조적 방법을 더욱 특징으로 할 수 있습니다. 동질성 단백질의 밀리그램 양을 정화함으로써, 이러한 기술은 아라비도시스 탈리아나 1 수송기의 결정 구조를 결정하는 데 사용되었다.
