Получение достаточного количества мембранных белков для применения ниже по течению остается важной технической проблемой. Этот протокол позволяет очищать несколько мембранных транспортных белков до однородности. Ключевым преимуществом этого метода является то, что Saccharomyces cerevisiae является временем и экономически эффективной эукариотической системой экспрессии мембранных белков, которая позволяет оптимизацию многих ключевых экспериментальных переменных.
Начните с инокулации трех преобразованных дрожжевых колоний, в 50 миллилитров полной дополнительной селективной среды без гистидина. Дополняется дрожжевой азотной базой и 2%глюкозой для ночной инкубации при 190 вращениях в минуту и 30 градусах по Цельсию. Удалите культуру на следующий день.
Используйте спектрофотометр для определения оптической плотности на 600 нанометров или OD 600. И привить каждый из четырех двухлитровых колбы, содержащей 500 миллилитров культуры среды до OD 600 из 0,01. Затем встряхните культуры на 190 вращений в минуту при 30 градусах по Цельсию в течение 30 часов, чтобы позволить клеткам потреблять все глюкозы и расти до высокой плотности.
Чтобы вызвать экспрессию транспортера бората, добавьте 125 миллилитров из пяти дрожжевых пептонов среды, дополненных 10%galactose при 190 вращениях в минуту при 30 градусах Цельсия в течение 16 часов. Затем урожай дрожжевых клеток центрифугации и повторно гранулы в 100 миллилитров холодной воды. Вихрь в вихре, чтобы повторно использовать дрожжевые гранулы и последовательно передавать решение, чтобы сделать это со всеми бутылками, содержащими гранулы.
Для сбора дрожжевых мембран, во-первых, добавьте 11,25 миллилитров одного моларного триса, 0,45 миллилитров 0,5 моларной ЭДТА и 2,25 миллилитров 100 миллимолейных ПМСФ в рсопенные клетки. Добавьте воду в конечный объем в 225 миллилитров и перенесите клетки в канистру для избиения 450 миллилитров металла. Доверху оставшийся объем холодными стеклянными бусинками диаметром 0,5 миллиметра и соберите бисерную камеру с ротором.
Погрузите камеру в ледяную ванну и выполните шесть одноминутных импульсов, разделенных на две минуты периода отдыха, чтобы предотвратить перегрев лисата. После последнего импульса, удалить фильтрационную мембрану из пластиковой одноразовой бутылки верхней фильтр привинчены в стеклянную бутылку и залить содержимое бисера бисером камеры на сборку при применении вакуума. Затем промыть с двумя х буфера мыть бисера, добавив к камере закрученного, а затем добавить в бисер.
Промыть бисером бисером камеры с 225 миллилитров мыть буфера и мыть бисер с содержимым камеры. Соберите лизат путем центрифугации и вы decant супернатанта в поликарбонатные бутылки для ультрацентрифугации для сбора мембран. В конце ультрацентрифугации отбрасывают супернатант и взвешивают бутылки мембранными гранулами перед повторной основой мембран примерно в 35 миллилитров мембранного буфера повторного незаменимия.
Добавить суспензии в стеклянный Douncer, а затем Dounce гомогенизировать мембраны aliquot гомогената в 50 миллилитров конической трубки для отрицательного 80 градусов по Цельсию хранения. Взвесь пустые бутылки центрифуги, чтобы определить массу собранных мембран. Для гелубилизации и очищения белка добавьте бар перемешивания и 150 миллиграммов DDM на грамм мембраны в стакан на льду и ресуспенйте размороженные мембраны до конечного объема в 15 миллилитров буфера реуспензии мембраны, дополненного одним миллимолярной ПМСФ и 20 миллимолярно-имидазолами на грамм мембраны.
Добавьте мембранный раствор в стакан в течение одного часа перемешивания в ледяной ванне. Затем центрифугация гранулировать неалубилизованный материал. В 4 градуса по Цельсию холодной комнате, фильтр супернатант через фильтр пятиметрового шприца и использовать перистальтический насос установлен на скорость потока одного миллилитра в минуту, чтобы загрузить образец на один миллилитр обездвиженные никеля сродства колонки Затем, мыть колонку с 10 объемов колонки мыть буфера и разбавить белок в буфере elution.
Сбор элуата в десять один миллилитр фракций. Вы запустите собранные подготовленные фракции геля на 4 до 20%Tris-Glycine SDS страницу гель вместе с solubilized лизат и мыть фракции при комнатной температуре, потянув пик собранных ускользает фракций для концентрации до 500 микро-литра или меньше объема в 50 кг далтон отсечения концентратор в скамейке центрифуги при четырех градусах Цельсия. Фильтр концентрированного белка через фильтр колонки спина 0,2 микрометра и ввести фильтрат на столбец исключения размера, уравновешенный в буфере S-200.
После запуска пиковых фракций на второй четыре-20%Tris-Глицин SDS страницу гель, пятно гель и собирать чистые пиковые фракции для концентрации в 50 кг Далтон отсечения концентратор на четыре градуса цельсия, как только что продемонстрировали. Затем измерьте абсорбанс образца белка на длине волны 280 нанометров, чтобы определить концентрацию перед хранением образца на неопределенный срок при отрицательных 80 градусах по Цельсию. Для выполнения глутаралдегида кросс-связывающего анализа, во-первых, добавьте 0,5 миллиграмма на миллилитр оттаявого белка в трех микролитров буфера S-200 до пяти микролитров буфера S200.
Завершите негативную реакцию контроля добавлением одного микролитора 20% додекилового сульфата натрия и одного микролитора 1,5%глутаралдегида. Завершите экспериментальные образцы с добавлением одного микро-литра воды и одного микро-литра 1,5%glutaraldehyde. После 30 минут при комнатной температуре прекратить реакцию с пятью микролитров 3x SDS страницы гель загрузки умереть, содержащий избыток буфера Tris, чтобы утолить глутаралдегид и загрузить все 15 микролитров раствора на четыре-20%Tris-Glycine SDS страницу гель.
Затем запустите гель на 200 вольт в течение 30 минут, прежде чем окрашивание, чтобы определить степень димер перекрестного соединения, о чем свидетельствует группа, которая работает в два раза больше денатурированных мономер. Пятно гель, встряхивая на медленной орбитальной шейкер с гель пятно добавил к гелю. Здесь типичные гели для ускользающей фракций из хроматографии сродства никеля показывают три частично очищенных белка с лисаторными фракциями, не демонстрирующими значительную полосу, соответствующую транспортеру бората, как ожидалось для белков, которые не более чем выражают хорошо.
Ad millimolar мыть полосу в каждом геле показывает минимальную потерю десяти гистидин помечены белка, несмотря на их относительно высокие излучатели старой концентрации. В то время как полосы, соответствующие транспортерам бората, очевидны в ускользающихся фракциях. Перед инъекцией колонки S200 белки недостаточно очищаются для многих приложений ниже по течению, о чем свидетельствуют дополнительные полосы в каждом образце.
После их введения в столбцы исключения размера однако, eluded фракции высокой чистоты можно наблюдать. Перекрестие показывает, что очищенные гомомерные транспортеры могут иметь свою сборку в растворе, легко оцениваемом с степенью перекрестной связи, зависящей от количества остатков лизина в непосредственной близости друг от друга Важно помнить, что как только начинается сбор клеток, белок должен быть холодным во все времена. Либо на льду в комнате на четыре градуса Цельсия, либо в гастрономе.
После этой процедуры мембранные белки могут быть дополнительно охарактеризованы биофизическими, биохимическими или структурными методами, включая рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии. Путем позволять очищение количеств миллиграмма однородного протеина, эти методы были использованы для того чтобы обусловить кристаллическую структуру arabidopsis thaliana один транспортер.
