Downstream uygulamaları için yeterli miktarda membran proteini elde edilmesi önemli bir teknik sorun olmaya devam etmektedir. Bu protokol, çeşitli membran taşıma proteinlerinin homojenliğe arındırılmasını sağlar. Bu tekniğin önemli bir avantajı Saccharomyces cerevisiae birçok önemli deneysel değişkenlerin optimizasyonu sağlayan membran proteinleri için bir zaman ve maliyet etkin ökaryotik ekspresyon sistemi olmasıdır.
Histidin olmadan tam ek seçici orta 50 mililitre, üç dönüştürülmüş maya kolonileri aşılayarak başlayın. Dakikada 190 dönüş ve 30 santigrat derece bir gecede kuluçka için maya azot tabanı ve% 2 glikoz ile desteklenmektedir. Ertesi gün kültürü kaldırın.
600 nanometre veya OD 600 optik yoğunluğunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Ve 500 mililitre kültür ortamı içeren dört iki litrelik şişenin her birini 0,01'lik bir OD 600'e kadar inoküle edin. Daha sonra 30 saat boyunca 30 saat boyunca dakikada 190 rotasyonlarda kültürleri sallayın, böylece hücreler tüm glikozu tüketin ve yüksek yoğunluğa kadar büyüyebilir.
Borat taşıyıcı ifade indüklemek için, beş x maya pepton orta 125 mililitre ekleyin, 16 saat boyunca 30 santigrat derece dakikada 190 rotasyonlarda% 10 galaktoz ile desteklenmektedir. Daha sonra mayak hücrelerini santrifüj le hasat edin ve 100 mililitre soğuk suda peleti yeniden askıya alın. Girdap girdap içinde girdap maya pelet yeniden askıya almak ve seri pelet içeren tüm şişeler ile bunu yapmak için çözüm aktarmak.
Maya membranları hasat etmek için, ilk olarak, bir azı tris 11,25 mililitre ekleyin, 0.5 molar EDTA 0.45 mililitre ve 100 milimolar PMSF 2.25 mililitre resuspended hücrelere. 225 mililitrelik son hacmine su ekleyin ve hücreleri 450 mililitrelik metal boncuk döven teneke kutuya aktarın. Soğuk 0,5 milimetre cam boncuk ile kalan hacmi kapalı top ve bir rotor ile boncuk boncuk odası monte.
Bir buz banyosu oda batırın ve lysate aşırı ısınmasını önlemek için iki dakikalık dinlenme süreleri ile ayrılmış altı bir dakikalık darbeler, gerçekleştirin. Son darbeden sonra, cam şişeye vidalanmış plastik tek kullanımlık şişe üst filtreden filtrasyon zarını çıkarın ve vakum uyguluyorken boncuk boncuk haznesinin içeriğini montaja dökün. Daha sonra iki x boncuk yıkama tampon ile durulayın oda girdap ekleyerek ve daha sonra boncuk ekleyerek.
225 mililitre yıkama tamponu ile boncuk boncuk odasını durulayın ve boncukları odanın içeriğiyle yıkayın. Santrifüj ile lysate toplamak ve membranların toplanması için ultracentrifugation için polikarbonat şişeler içine supernatant decant. Ultracentrifugation sonunda supernatant atın ve membran resuspension tampon yaklaşık 35 mililitre membranlar resuspend önce membran pelet ile şişe tartMak.
Bir cam Douncer süspansiyonlar ekleyin, sonra negatif 80 santigrat depolama için 50 mililitrelik konik tüp içine homojen bir aliquot membranlar homojenize Dounce. Hasat edilen membranların kütlesini belirlemek için boş santrifüj şişelerini tartın. Protein solubilizasyon ve saflaştırma için, bir karıştırma çubuğu ve membran gram başına DDM 150 miligram buz üzerinde bir kabın ve membran resuspension tampon 15 mililitre son hacmine çözülmüş membran membran resuspension tampon, bir milimolar PMSF ve membran gram başına 20 milimolar imidazolile takviye çözülmüş membran resuspend son hacmine askıya ekleyin.
Bir buz banyosunda karıştırarak bir saat için kabına membran çözeltisi ekleyin. Ardından çözünmeyen malzemeyi peletlemek için santrifüj. 4 derece santigrat soğuk odada, beş mikrometre şırınga filtresi ile supernatant filtre ve bir mililitre immobilize nikel yakınlık sütun üzerine örnek yüklemek için dakikada bir mililitre akış hızına ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanın Sonra, yıkama tampon 10 sütun hacimleri ile sütun yıkayın ve elution tampon protein seyreltmek.
On bir mililitre kesirlerde eluat toplama. Toplanan hazırlanan jel fraksiyonlarını 4 ila %20 Tris-Glycine SDS sayfa jelinde çözünür lysate ile birlikte çalıştırın ve oda sıcaklığında kesirleri yıkayın, toplanmış kesirleri konsantrasyon için 500 mikro litre veya daha az hacimli bir 50 kilo dalton kesme konsantratöründe 4 derece santigrat derecede niçin toplayın. Konsantre proteini 0,2 mikrometrelik spin kolon filtresinden filtreleyin ve filtratı S-200 tamponunda dengelenmiş bir boyut dışlama sütununa enjekte edin.
Ikinci bir dört ila% 20 Tris-Glisin SDS sayfa jel üzerinde pik kesirler çalıştırdıktan sonra, jel leke ve konsantrasyon için saf pik fraksiyonları toplamak 50 kilo Dalton kesme konsantratörü dört derece santigrat az gösterdiği gibi. Daha sonra protein örneğinin absorbansını 280 nanometre dalga boyunda ölçün ve numuneyi negatif 80 santigrat derecede süresiz olarak saklamadan önce konsantrasyonu belirleyin. Bir glutaraldehit çapraz bağlantı tayini gerçekleştirmek için, ilk olarak, S-200 tampon üç mikrolitre çözülmüş protein mililitre başına 0.5 miligram ekleyin S200 tampon beş mikrolitre.
Negatif kontrol reaksiyonu% 20 sodyum dodecyl sülfat ve% 1.5 glutaraldehit bir mikrolitre ilave si ile tamamlayın. Deneysel numuneleri bir mikro litre su ve bir mikro litre %1.5 glutaraldehit ilave si ile tamamlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra glutaraldehit söndürmek ve dört ila% 20 Tris-Glisin SDS sayfa jel üzerine çözeltinin tüm 15 mikro litre yüklemek için Tris tampon aşırı içeren 3x SDS sayfa jel yükleme die beş mikrolitre ile reaksiyonu sona erdirmek.
Daha sonra, denatüre monomer iki katı büyüklüğünde çalışan bir bant tarafından kanıtlanmış olarak dimer çapraz bağlantı ölçüde belirlemek için boyama önce 30 dakika boyunca 200 volt jel çalıştırın. Jel leke jel eklendi yavaş bir orbital shaker sallayarak jel leke. Burada nikel afinite kromatografisinden elde edilen kesirler için tipik jeller, kısmen saflaştırılmış üç proteinin, lysate fraksiyonları ile birlikte, iyi ifade yapmayan proteinler için beklendiği gibi borat taşıyıcısına karşılık gelen önemli bir bant göstermediğini göstermektedir.
Her jel reklam milimolar yıkama şeritli onların nispeten yüksek yayıcılar eski konsantrasyonrağmen on histidin etiketli protein minimal kaybı gösterir. Borat taşıyıcılarına karşılık gelen bantlar eluded kesirlerde kolayca görünür iken. S200 kolon enjeksiyonundan önce, proteinler her numunedeki ekstra bantlarda belirtildiği gibi birçok downstream uygulaması için yeterince saflaştırılamamaktadır.
Ancak boyut dışlama sütunlarına enjekte edildikten sonra, yüksek saflıkta kaçan kesirler görülebilir. Crosslinking saflaştırılmış homomerik taşıyıcıların, birbirine yakın lizin kalıntılarının sayısına bağlı olarak çapraz bağlanmanın boyutuyla çözümde montajlarını kolayca değerlendirebileceklerini göstermektedir Hücre hasadı başladıktan sonra proteinin her zaman soğuk tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ya dört derecelik bir odada buz üstünde ya da bir şarküteri de.
Bu prosedürü takiben membran proteinleri x-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskobu gibi biyofizik, biyokimyasal veya yapısal yöntemlerle daha da karakterize edilebilir. Homojen protein miligram miktarlarının saflaştırılmasını sağlayarak, arabidopsis thaliana bir taşıyıcının kristal yapısını belirlemek için bu teknikler kullanılmıştır.
