La matrice extracellulaire ou les microparticules d’hydrogel numérique ECM peuvent être utilisées comme éléments constitutifs pour la fabrication d’échafaudages. Ce protocole démontre la fabrication, la purification, la lyophilisation, l’assemblage de photos et la bioimpression 3D de microparticules de méthacryloyl de gélatine ou d’hydrogel GelMA. GelMA est un biopolymère photochimiquement, réticulable, à base de protéines contenant de l’adhésif cellulaire et des fractions biodégradables qui a été largement utilisé comme biomatériau instructif et sensible aux cellules.
Par rapport à l’hydrogel en vrac conventionnel, les échafaudages d’hydrogel granulaire GelMA sont microporeux, permettant une infiltration cellulaire rapide qui peut être adaptée en fonction de la taille du bloc de construction. Les échafaudages d’hydrogel granulaire GelMA peuvent ouvrir de nouvelles opportunités pour la bio-impression 3D de tissus épais, d’organes et de maladies sur des plates-formes bon marché et l’ingénierie régénérative. Pour commencer, ajoutez 10 milligrammes de LAP à 10 millilitres de DPBS pour préparer une solution photoinitiatrice à 0,1%.
Protégez la solution de la lumière en l’enveloppant de papier d’aluminium et étiquetez-la. Ensuite, dissoudre la quantité désirée de GelMA dans la solution photoinitiatrice. Placez la solution enveloppée de papier d’aluminium dans le four à 37 degrés Celsius pendant une heure pour obtenir une solution claire.
Pour préparer la phase huileuse, fabriquer une solution tensioactive biocompatible à 2% dans le fluide technique. Insérez le tube Tygon dans les entrées et la sortie du dispositif PDMS, puis insérez une aiguille émoussée de calibre 25 à l’autre extrémité du tube Tygon pour les entrées. Placez l’appareil sous le microscope et gardez l’environnement chaud à environ 40 degrés Celsius à l’aide d’un sèche-cheveux ou d’un radiateur.
Chargez les solutions aqueuse et huileuse dans des seringues séparées connectées à l’appareil. Démarrez la pompe à seringue pour la phase huileuse avec un débit de 160 microlitres par minute. Une fois que l’huile a rempli le canal, démarrez la phase aqueuse à 80 microlitres par minute.
Vérifiez la formation de gouttelettes au microscope. Recueillir les gouttelettes dans un récipient et les évaluer dans la chambre d’imagerie par imagerie par microscopie optique. Gardez les gouttelettes à quatre degrés Celsius pendant la nuit tout en les protégeant de la lumière pour initier la réticulation physique du microgel GelMA et convertir les gouttelettes en microgels stables.
Pour mettre en œuvre la méthode MEtoP (micro-ingénierie émulsion-poudre), collectez les microgels physiquement réticulés dans le fluide d’ingénierie à l’aide de tubes microcentrifuges ou de cryoflacons thermiquement durables. Scellez le tube ouvert avec une lingette de laboratoire et du ruban adhésif. Congeler les microgels physiquement réticulés dans de l’azote liquide pendant 10 minutes pour procéder à la lyophilisation.
Après lyophilisation, une poudre solide sera obtenue. Ajouter un millilitre de solution photoinitiatrice refroidie à 0,1% à quatre degrés Celsius à la poudre lyophilisée pour obtenir des suspensions de microgel. Centrifuger le mélange vortex à 3 000 g pendant 15 secondes.
Après avoir jeté le surnageant, transférer la suspension de microgel emballée dans un moule à l’aide d’une pipette à déplacement positif et l’exposer à la lumière à une longueur d’onde de 400 nanomètres avec une intensité de 15 milliwatts par centimètre carré pendant 60 secondes pour former des échafaudages d’hydrogel granulaires ou GHS. Pour 400 microlitres de suspension de microgel, ajoutez une quantité égale de solution de PFO glacée, 20% dans un fluide technique aux microgels GelMA physiquement réticulés. Ensuite, centrifuger le mélange vortex à 300g pendant 15 secondes, et retirer la phase huileuse des microgels GelMA par pipetage.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de solution photoinitiatrice glacée à 0,1% à la suspension de microgel. Après avoir centrifugé la solution vortée à 300g pendant 15 secondes, jeter l’huile. Répétez les étapes d’addition de solution photoinitiatrice et de centrifugation, mais centrifugez à 3 000 g cette fois et jetez le surnageant des microgels GelMA emballés.
Transférer les microgels GelMA emballés dans un moule, puis une exposition à la lumière pour former le SGH. Ajouter 100 milligrammes de poudre de nanoplaquettes à trois millilitres d’eau glacée et ultra-pure pour former une dispersion de nanoparticules de 3,33%. Vortex la dispersion vigoureusement à l’intérieur d’un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour exfolier les nanoparticules agrégées.
Des nanoparticules correctement exfoliées donnent une dispersion claire. Dissoudre 50 milligrammes de LAP dans cinq millilitres d’eau glacée ultra-pure pour préparer une solution mère photoinitiatrice à 1%. Ajoutez ensuite 333 microlitres de solution photoinitiatrice à 1% à la dispersion de nanoparticules exfoliées et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière ambiante.
Vortex le mélange pendant une minute pour mélanger la dispersion de nanoparticules et le photoinitiateur. Ajoutez du PFO glacé, 20% dans un fluide technique aux microgels GelMA physiquement réticulés à un rapport de volume de un pour un. Après avoir centrifugé le mélange vortex à 300g pendant 15 secondes, jeter la phase huileuse contenant le tensioactif.
Ajoutez la dispersion de nanoparticules glacée supplémentée en LAP aux microgels GelMA lavés. Après centrifugation à 3 000 g pendant 15 secondes, jeter l’huile restante au fond et la dispersion surnageante. Conservez la suspension à quatre degrés Celsius tout en la protégeant de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium pendant une journée pour obtenir le produit GelMA nanoengineered granular bioink ou NGB.
Le lendemain, chargez le NGB dans une seringue de trois millilitres. Scellez la seringue chargée avec un capuchon et un parafilm, et faites une centrifugation pulsée à 200 g pour éliminer l’air emprisonné. Transférez la bio-encre dans une cartouche de trois millilitres à l’aide d’un connecteur de verrouillage Luer femelle-femelle.
Centrifuger brièvement la cartouche à 200 g pour éliminer l’air emprisonné et maintenir le NGB à quatre degrés Celsius avant utilisation. Ensuite, chargez la suspension de cellules de fibroblastes murins préparée dans une seringue de trois millilitres. Associez le NGB et les seringues chargées de cellules à l’aide d’un connecteur de verrouillage Luer femelle-femelle, et mélangez doucement le contenu en poussant d’avant en arrière 40 fois.
Imprimez le NGB ou le NGB chargé de cellules à l’aide d’une bio-imprimante appropriée avec une buse conique standard en chargeant la buse dans la tête d’impression de trois millilitres. Maintenez la température du lit d’impression en dessous de 10 degrés Celsius et optimisez des paramètres tels que la vitesse et la contre-pression. Sélectionnez le fichier gcode ou STL souhaité.
Sélectionnez ensuite le substrat et le type de buse pour une seringue pneumatique de trois millilitres équipée d’une buse conique standard. Calibrez la bioimprimante en utilisant les directives de l’appareil et commencez à imprimer pour obtenir les structures 3D. La technologie MEtoP a permis d’obtenir de la poudre de microgel séchée resuspension par lyophilisation à basse pression tout en protégeant les microgels de l’agrégation et des déformations sévères.
Les images MEB ont montré que les microparticules GelMA séchées utilisant cette technologie conservent leur forme sphérique après lyophilisation par rapport à l’agrégation observée avec la lyophilisation conventionnelle. La caractérisation des micropores de GelMA, GHS et NGB avec un colorant de fluorescence de poids moléculaire élevé a montré les espaces vides à micro-échelle interconnectés. De plus, l’image de fluorescence évaluée à l’aide d’un script MATLAB personnalisé a détecté les pores.
Les mesures de la fraction vide et du diamètre médian de l’équivalent des pores n’ont montré aucune différence significative attestant de la disponibilité et de l’interconnectivité des pores à l’échelle microscopique dans les échafaudages imprimés en 3D à l’aide du NGB. La supériorité des échafaudages NGB par rapport aux microgels GelMA emballés de manière serrée et lâche par la mesure de la longueur du filament suspendu a révélé que le NGB avait une longueur supérieure à celle des microgels emballés. Les microgels emballés en vrac n’ont pas produit de filaments.
Un cylindre creux a été imprimé en 3D et l’ensemble de la construction a été exposé à la lumière pour la photoréticulation. La structure imprimée a été physiquement maintenue pour montrer la forme, la fidélité et l’intégrité structurelle. Si l’échafaudage est utilisé pour l’évaluation biologique, par exemple dans la bio-impression chargée de cellules, n’oubliez pas d’effectuer toutes les étapes sous certaines conditions, sous l’enceinte de sécurité biologique.
Nous espérons décommercialiser l’utilisation d’échafaudages d’hydrogel granulaire en tant que plate-forme de biomatériaux nouvellement émergé en biomédecine.
