Ce protocole démontre une nouvelle méthode pour l’édition du génome multiplexe de Saccharomyces cerevisiae en introduisant des cassettes d’expression multiples sur différents locus en une seule étape de transformation. Cette approche d’assemblage plasmide libre de clonage pour exprimer un seul tableau de crRNA, mène à un protocole rapide, efficace, et flexible d’édition de génome. Nous allons concevoir des cellules de levure de type sauvage, pour produire des caroténoïdes en introduisant des gènes héterologeux gratuits sur les loci génomiques libres.
Le tableau crRNA unique est composé de crARN individuels libres exprimés à partir de promoteur libre de polymésase d’ARN. Cas12a traite in vivo le tableau crRNA en crARN individuels. Les crARN guident Cas12a vers le loci cible sur l’ADN génomique où Cas12a introduit des ruptures de double brin.
Les fragments d’ADN vers le bas se recombinent pour la recombinaison in vivo et s’intègrent dans l’ADN génomique. Klaudia Ciurkot, doctorante, démontrera le protocole. Jeffery van Wijk, scientifique associé.
Et Brenda Vonk, scientifique associée principale de notre laboratoire. Après avoir obtenu un seul tableau crRNA pour les expériences d’édition du génome multiplex de l’ADN synthétique, préparer le mélange d’amplification PCR, et charger le tableau dans le thermocycleur pour l’amplification. Pour analyser les produits PCR par électrophorèse, exécutez les échantillons sur un gel agarose de 0,8 % à 5 V/cm pendant 40 minutes.
Chargez l’échelle d’ADN avec les fragments d’ADN allant de 100 10000 paires de base Puis purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Pour la transformation de levure, commencez par pré-culture de levure de type sauvage dans un flacon de 100 mL contenant 20 mL d’extrait de levure peptone dextrose ou YEPD moyen. Pour une incubation d’une nuit, à 30 degrés Celsius, et 250 rotations par minute Le lendemain matin, inoculer 20 mL de milieu frais YEPD avec un volume calculé de levure pré-culture pendant la nuit.
Placez la culture dans un incubateur secouant jusqu’à ce qu’une densité optique de 1,0, mesurée à 600 nanomètres soit atteinte. Récolter les cellules de levure par centrifugation. Lavez la pastille de cellules de levure dans 20 mL d’eau déminéralisée à température ambiante, suivie d’une centrifugation supplémentaire.
Resuspendez la pastille dans 100 microlitres de solution tris-EDTA d’acétate de lithium, et transférez la levure dans un tube de microcentrifugeuse. Mélanger cinq microlitres d’ADN porteur à brin unique et un microgramme de pCSN067 plasmide avec la suspension des cellules de levure. Mélangez ensuite 600 microlitres de solution LiAc-TE de polyéthylène glycol avec l’échantillon.
Incuber les cellules de levure et le plasmide pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius et 450 prm dans un bloc thermique supérieur à la table. À la fin de l’incubation, mélanger 70 mL de sulfure de diméthyle avec la solution de transformation. Chauffer le mélange pendant 15 minutes dans un bain d’eau de 42 degrés Celsius.
Transférer le mélange dans un tube de fond rond de 15 mL. Ajouter 10 mL de YEPD au tube pour une incubation d’une nuit à 30 degrés Celsius et 250 rpm. Le lendemain matin, recueillir les cellules transformées par centrifugation, et aspirer tous sauf les 200 derniers microlitres du supernatant.
Resuspendez la pastille de cellules de levure transformée dans le supernatant restant. Plaque 150 microlitres du mélange de transformation, et 150 microlitres d’une dilution 20 fois des 50 microlitres restants de mélange de transformation dans YEPD, sur des plaques d’agar YEPD, complétées par 0,2 grammes par litre de G418. Après 48 à 72 heures à 30 degrés Celsius, choisissez un seul transformateur pour resserrage sur une nouvelle plaque d’agar YEPD complétée par 0,2 g/L de G418.
Pour la deuxième transformation, faire croître la culture à une densité optique à 600 nanomètres de 1,0, comme nous venons de le démontrer. Et ajouter 20 microlitres de cellules à un tube de microcentrifugeuse. Après centrifugation, resuspendez la pastille cellulaire dans 100 microlitres de la solution LiAc-TE, et ajoutez ssDNA.
Dans un tube séparé, combinez un microgramme du tableau unique de crRNA, un microgramme du plasmide destinataire linéarisé pour le tableau de crRNA, un microgramme de chaque ADN de donateur, et un microgramme de chaque région de flanc. Puis transférer le mélange d’ADN dans le tube de cellules de levure compétentes et compléter la deuxième transformation comme démontré pour la première transformation. Le lendemain matin, recueillir les cellules par centrifugation et réutiliser la pastille dans un petit aliquot de supernatant.
Puis plaque 150 microlitres du mélange de transformation, et 150 microlitres d’une dilution 20 fois du mélange de transformation dans le milieu YEPD, sur des plaques d’agar YEPD complétées par 0,2 g/L G418, et 0,2 g/L de nourseothricin Après 48 à 72 heures, à 30 degrés Celsius, choisissez un seul transformateur coloré pour le resserrage sur une nouvelle plaque YEPD pour obtenir une seule colonies colorées. Pour déterminer l’efficacité de l’édition du génome, comptez le nombre de colonies colorées et blanches sur les plaques de transformation et divisez le nombre de colonies colorées par le nombre total de colonies. Pour créer l’art pixel de levure, inoculer des flacons individuels de secousse de 500 mL contenant 100 mL de milieu YEPD avec trois caroténoïdes de couleur différente produisant des souches de S.cerevisiae, et un type sauvage CEN.
Souche PK113-7D. Incuber les cultures pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec des secousses à 250 rpm. Transférer 0,5 mL de chaque culture nocturne vers des tubes individuels contenant 0,5 mL de gradient de densité stérile et non ionique moyen par tube, et mélanger brièvement les solutions par vortex.
Transférer les suspensions cellulaires dans un réservoir individuel qualifié 2 par 3 puits. Utilisez un fichier csv avec le réglage d’étalonnage des fluides 6RES_AQ_GPSA2 sur un instrument acoustique de manutention de liquide pour repérer 25 nanolitres de chaque souche S.cerevisiae de la plaque source de réservoir qualifiée appropriée sur une microplaque de destination de puits 6144 contenant 50 mL d’agar YEPD. Lorsque tous les puits ont été repérés, incuber la microplaque à 30 dégressivité Celsius pendant 48 heures.
Pour intensifier les couleurs des souches, conserver les plaques d’agar à 4 degrés Celsius pendant au moins 72 heures. Une photo de Rosalind Franklin est apparue dans l’assiette. Comme démontré, promoteur, cadre de lecture ouvert, terminator, et deux séquences contiguës connecteur de 50 bp peuvent être assemblés dans une cassette d’expression via une réaction de clonage Golden Gate, et vérifié par PCR.
Après amplification du tableau de crRNA simple par PCR, le plasmide destinataire pour le tableau unique de crRNA est linéarisé comme confirmé par l’électrophoresis. L’efficacité de l’édition du génome multiplexe peut être calculée par le pourcentage de colonies colorées après la transformation, et par les résultats des analyses PCR qui confirment l’intégration de l’ADN des donneurs aux emplacements prévus de l’ADN génomique. Par exemple, à partir d’une image en noir et blanc de Rosalind Franklin, une liste de quatre couleurs et de repérage a été créé qui a ensuite été utilisé pour repérer les quatre souches de levure différentes sur une microplaque d’agar par l’intermédiaire d’un gestionnaire de liquide acoustique, comme démontré, résultant en une peinture à haute résolution de levure du scientifique.
Pour cette transformation, utilisez des solutions fraîchement préparées et des fragments d’ADN de haute qualité. Cette méthode peut également être appliquée pour l’introduction multiplexe de suppressions définies et de mutations ponctuelles dans l’ADN génomique. En outre, des expériences de régulation CRISPR peuvent être réalisées.
Cette méthode peut être modifiée pour introduire plus de crARN gratuits dans un tableau afin d’augmenter le nombre de modifications simultanées qui peuvent être apportées.
