Notre protocole explique comment concevoir, construire et analyser des circuits numériques de gènes de levure qui utilisent les systèmes CRISPR dCas de type deux et de type cinq et les protéines anti-CRISPR correspondantes. C’est un séjour d’assemblage car il ne rassemble aucune procédure standard pour assembler et tester des réseaux transcriptionnels synthétiques dans les services. Pour commencer, préparez un mélange réactionnel contenant 20 à 40 nanogrammes de matrice d’ADN, un microlitre d’amorce directe, un microlitre d’amorce inverse, cinq microlitres de mélange DNTP, 0,5 microlitre d’ADN polymérase, 10 microlitres de tampon de réaction ADN polymérase 5x et double eau distillée jusqu’à un volume total de 50 microlitres.
Amplifier les séquences d’ADN à l’aide du programme de PCR d’atterrissage sur un thermocycleur comme décrit dans le manuscrit. Isoler les produits PCR par électrophorèse sur gel et diluer les séquences d’ADN du gel d’agarose via un kit d’extraction de gel d’ADN. À l’aide de la méthode d’assemblage Gibson, insérer les produits PCR purifiés dans le vecteur navette ouvert en laissant entrer le mélange d’ADN équimolaire à 50 degrés Celsius pendant une heure.
Construire le vecteur accepteur dCas12a via la PCR tactile et la méthode d’assemblage Gibson comme démontré précédemment. Insérez les protéines dCas12a optimisées pour le codon de levure dans les deux vecteurs accepteurs nouvellement construits par digestion avec BamH1 et Xhol1 et ligature avec T4 DNA ligase. De même, construisez les plasmides en fonction du vecteur navette pRS2403 pour exprimer les protéines anti-CRISPR via la PCR au toucher des roues et la méthode d’assemblage Gibson.
Pour effectuer la détection de cellule de microscopie, placez deux microlitres de la solution cellulaire sur une lame de verre et recouvrez-la d’un couvercle. Observez les cellules sous un microscope à fluorescence en allumant la source de lumière fluorescente, le microscope et l’ordinateur. Après avoir noté le numéro de la source de lumière fluorescente, ouvrez le logiciel du microscope sur l’ordinateur.
Placez la lame sur la platine du microscope et choisissez l’objectif 40x tout en observant les cellules sous la lumière verte. Déplacez le bouton de mise au point jusqu’à ce que le contour des cellules de levure apparaisse et le bouton de mise au point fin pour concentrer les cellules. Pour détecter les cellules, après avoir fermé le champ de vision du microscope, passez à l’écran de l’ordinateur et cliquez sur en direct.
Attendez trois à cinq secondes. Cliquez sur capturer pour prendre une photo et enregistrer l’image. Ensuite, éteignez l’ordinateur, le microscope et la source de lumière fluorescente.
Allumez la machine FACS 20 minutes avant les mesures pour réchauffer le laser et mélanger 20 microlitres de culture cellulaire avec 300 microlitres d’eau distillée double. Exécutez le logiciel FACS sur l’ordinateur connecté à la machine FACS et créez une nouvelle expérience. Réglez ensuite les paramètres de mesure.
Ensuite, sélectionnez le filtre en fonction des longueurs d’onde d’excitation et d’émission des échantillons et définissez le numéro de cellule d’acquisition sur 10 000. Ajustez la tension du filtre FITC en mesurant l’intensité des billes fluorescentes, en veillant à ce que la différence relative d’intensité des billes entre deux expériences consécutives ne dépasse pas 5%Lavez la machine avec de l’eau distillée double pendant quelques secondes pour éliminer tout excès éventuel de billes. Mesurez l’intensité de fluorescence de l’échantillon et cliquez sur l’aperçu en attendant trois à cinq secondes pour la stabilité de l’injection de l’échantillon.
Enfin, cliquez sur acquérir. Mesurez à nouveau les perles à la fin de l’expérience. Après avoir vérifié si la différence relative entre les deux mesures de perles dépasse 5%Exportez les données FACS sous forme de fichiers FCS.
Ouvrez R studio et chargez le script BDverse_analysis. R pour analyser les fichiers FCS. Définissez le nom de l’expérience sur ename, le chemin du répertoire où les fichiers FCS sont stockés en tant que dir_d et les fichiers de résultats seront créés en tant que dir_r.
Ensuite, définissez le canal de fluorescence. Définissez le nombre d’échantillons mesurés. Dimensions des diagrammes à points et longueur maximale des axes x et y pour les diagrammes à barres et les diagrammes en boîte.
Choisissez la méthode de notation en supprimant le hashtag des lignes correspondantes. Sélectionnez l’objet flowSet correspondant à la méthode de contrôle choisie et la résolution du tracé de points, qui doit être au moins égale à 256. Décommentez les deux instructions de filtrage pour supprimer les mesures où la fluorescence est négative et pour éliminer les valeurs aberrantes dues à d’autres expériences décrites dans le manuscrit.
Appuyez sur la source et exécutez le script. Tous les fichiers contenant les résultats de l’analyse sont créés dans dir_r. La meilleure efficacité d’activation de dSpCas9-VP64 a été obtenue lorsqu’il y avait six sites cibles lexOp sur le promoteur synthétique.
Alors que pour dCas12a-VPR l’efficacité d’activation la plus élevée lorsque trois copies de lexOp ont été insérées dans le promoteur synthétique. L’activation par l’ARN CRISPR et l’ARN guide unique situés sur un plasmide intégratif était de 1,4 à 2,4, et 1,1 à 1,5 fois plus élevée que lorsqu’elle était placée sur un plasmide épisomique. Les résultats de la RT-qPCR ont montré qu’un vecteur épisomique produisait un niveau beaucoup plus élevé d’ARN CRISPR monoguide que le vecteur intégratif, quel que soit le système d’expression.
L’efficacité d’activation du complexe dSpCas9 et de l’ARN d’échafaudage recrutant MCP-VP64 a été testée. L’ARN de l’échafaudage contenant un seul type sauvage et une épingle à cheveux F6MS2 a donné une activation de 5,27 et 4,3 fois respectivement. Cependant, la combinaison des deux épingles à cheveux a donné 7,54 fois avec la plus grande efficacité d’activation.
Quatre promoteurs différents ont été utilisés pour conduire l’expression de trois types d’anti-CRISPR de type deux, montrant qu’ils fonctionnaient de manière dose-dépendante. Un promoteur puissant a réduit le niveau de fluorescence à 0,21, 0,11 et 0,13 de sa valeur respectivement. La courbe de titrage montre que le circuit se comporte comme une démarche de nœuds avec un rapport marche/arrêt approchant 2,3.
L’anti-CRISPR A de type cinq réduit l’expression de fluorescence de denAS-Cas12a et dLB-Cas12a en tant qu’activateurs de 19% à 71%La relation entre activateurs et répresseurs a été étudiée où l’Acr-VA a montré de grandes fluctuations de ses performances lorsqu’il est produit par pGAL1 sous pTEF1 et génétique CYC1t-pCYC1noTata type cinq anti-CRISPR-A1 a montré une certaine répression sur le dLB Cas12a nu seulement. La machine FACS est fragile, elle doit donc être manipulée avec précaution. La solution cellulaire ne doit jamais être trop dense et la machine doit être maintenue propre.
