Le domaine de recherche de Shigella manque actuellement d’essais bien définis pour examiner le rôle fonctionnel des anticorps générés par la vaccination ou l’infection. Cet essai représente une méthode bien définie pour qualifier ces réponses immunitaires et mesurer l’activité bactéricide des anticorps spécifiques de Shigella. Le principal avantage de cet essai est qu’il permet une analyse à haut débit de plusieurs échantillons.
Les techniques utilisées dans ce protocole réduisent considérablement le temps pratique et le temps d’analyse global pour mesurer la mise à mort bactérienne directe des anticorps et des échantillons de sérum. Pour commencer, incuber les échantillons dans un bain d’eau chaude à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes pour chauffer et activer les échantillons d’essai. Obtenez une plaque d’essai et 20 microlitres de tampon d’essai aux colonnes une à douze rangées A à G.Ajoutez 20 microlitres de tampon d’essai aux colonnes un et deux de la rangée H.Chargez 30 microlitres de chaque échantillon d’essai et dupliquez pour ramer H de la plaque d’essai.
Pour commencer à effectuer trois dilutions périodiques des échantillons d’essai, utilisez une pipette multicanal pour enlever 10 microlitres des puits 3H à 12H. Transférer les échantillons dans les puits correspondants dans la rangée G et pipette de haut en bas 8 à 10 fois pour bien mélanger l’échantillon. Ensuite, retirez 10 microlitres de ces puits.
Transférer aux puits correspondants dans la rangée F et pipette de haut en bas 8 à 10 fois pour mélanger. Continuer ce processus de dilution en série à travers la rangée A.Après avoir mélangé les puits dans la rangée A, enlever et jeter 10 microlitres des puits 3A à 12A de sorte que le volume final dans tous les puits est de 20 microlitres. Récupérer un flacon de bouillon bactérien cible congelé et le décongeler à température ambiante.
Ensuite, diluer les bactéries en 20 millilitres de tampon d’essai. selon le facteur de dilution optimal prédéterminé. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 10 microlitres de bactéries diluées à chaque puits de la plaque d’essai.
Récupérez une fiole de baby rabbit compliment congelé et un flacon de chaleur congelée activé BRC. Utilisez de l’eau courante froide pour décongeler les flacons à température ambiante. Ensuite, mélangez 100 microlitres de CHALEUR activés BRC avec 400 microlitres de tampon d’essai.
Ajoutez 50 microlitres de cette solution BRC activée à 20 % par la chaleur à tous les puits de la colonne 1. Mélanger un millilitre de BRC indigène avec quatre millilitres de tampon d’essai. Ajouter 50 microlitres de ce mélange de 20 pour cent à tous les puits dans les colonnes deux à douze.
Placez la plaque un shaker de plaque pendant 10 à 15 secondes pour mélanger doucement la plaque d’essai. Incuber la plaque d’essai dans un incubateur microbiologique pendant deux heures. Pendant ce temps, retirez les couvercles des deux plaques d’agar LB et placez les plaques face vers le haut dans un coffret de sécurité biologique pendant 40 à 60 minutes pour sécher.
Lorsque l’incubation est terminée, transférer la plaque d’essai dans la glace humide et incuber pendant 10 à 20 minutes pour arrêter la réaction. À l’aide d’une pipette à douze canaux, mélanger les puits dans la rangée H et repérer la plaque 10 microlitres du mélange de réaction sur le fond d’une plaque LBA. Inclinez immédiatement la plaque et laissez les taches courir pendant environ 1,5 à 2 centimètres.
Répétez cette procédure pour les lignes G, F et E, en les remarant au-dessus de la ligne précédente. Incuber les plaques LBA à température ambiante jusqu’à ce que la solution soit absorbée dans les plaques LBA. Ensuite, mettez les couvercles sur les plaques et transférez-les à l’envers dans un incubateur microbiologique pour incuber pendant la nuit.
Le lendemain, ajoutez 25 millilitres d’agar superposé à 55 degrés Celsius, contenant 100 microgrammes par millilitre de TTC et 0,1 % d’azide de sodium à chaque plaque LBA. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre aux bactéries survivantes de développer une couleur rouge. Ensuite, utilisez un appareil photo numérique pour photographier les plaques.
Transférez les images sur un ordinateur et utilisez le logiciel d’énumération des colonies intégrées de NIST pour analyser les images telles qu’elles sont décrites dans le protocole texte. Les plaques représentatives de LBA démontrent que le développement de couleur a eu lieu après l’incubation et l’addition de superposition de nuit, avec toutes les colonies survivantes étant visibles en rouge. La mise à mort bactérienne est clairement visible pour tous les échantillons testés dans les trois premières dilutions.
Une diminution de la mise à mort bactérienne est observée à mesure que les échantillons sont dilués plus haut dans la plaque et que le sérum est moins concentré. Les comptes de microcolonie sont ensuite effectués à l’aide du logiciel NIST. Le nombre moyen de CFU pour chaque dilution de chaque échantillon est ensuite calculé, tout comme la valeur de mise à mort de 50 p. 100.
Cette valeur de mise à mort de 50 pour cent est ensuite appliquée aux CFUs moyens pour chaque dilution sérique afin de déterminer les valeurs nécessaires au calcul de l’ASB KI. Ce protocole repose sur un placage bactérien uniforme et uniforme sur LB Auger. Une bonne technique de placage et d’inclinaison permettra la croissance de microcolonies discrètes et le comptage précis des colonies. Cette technique utilise shigella virulente vivante et nécessite une technique aseptique appropriée et PPE pour s’assurer que les bactéries sont manipulées en toute sécurité selon les procédures BSL 2.
