Les auteurs remercient le Collège régional VA-MD de la médecine vétérinaire pour fournir de base et de soutien technique pour ce projet. Ce travail est soutenu par un Career Development Award NIH (K01DK092355).

Toutes les études ont été menées sous l&#39;approbation du Comité des soins et institutionnel (IACUC) pour Virginia Tech et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Une. Intratrachéale (it) inoculation de LPS aide de l&#39;Administration de l&#39;oropharynx <ol><li> Assurez-vous que chaque animal est identifié en utilisant soit un coup de poing de l&#39;oreille, une étiquette d&#39;oreille, ou toute autre méthode approuvée institutionnellement. </li><li> Noter le poids corporel de base et la température du corps de chaque animal. </li><li> Préparer le stock de travail de LPS. Chaque souris reçoit une dose de 50 pi de 1 mg / kg de LPS dans 1 x tampon phosphate salin (PBS). Animaux traités Mock recevront une dose de 50 pi de PBS 1x. </li><li> Préparer une chambre chargée de l&#39;administration de l&#39;isoflurane en utilisant la méthode de la goutte suivante. Les directives institutionnelles varient en ce qui concerne l&#39;utilisation de l&#39;isoflurane et d&#39;autres agents anesthésiques et avant Initiattion des études, les personnes doivent communiquer avec le Service de protection des animaux / Bien-être de leur institution pour assurer les toutes les directives sont satisfaits. Si la méthode de chute isoflurane n&#39;est pas une option, d&#39;autres agents anesthésiques sont des alternatives acceptables. <ol><li> Dans une armoire de sécurité approprié, appliquer environ 3 ml d&#39;isoflurane à une serviette de papier absorbant plié et le placer dans le fond d&#39;un bécher de 500 ml. </li><li> Placer un petit morceau de papier d&#39;aluminium sur le dessus de la serviette en papier et couvrir le bol avec un couvercle transparent. </li></ol></li><li> Préparer les outils et les réactifs qui seront utilisés au cours de l&#39;inoculation il. Placez la bande de caoutchouc afin de garantir les animaux se dirigent sur le stand de l&#39;intubation. Cette procédure nécessite une paire de pinces droites, une paire de pinces inclinées ou courbes, et une pipette P200 avec des conseils. </li><li> Charge 50 pi de LPS dans la pointe de la pipette et le placer dans un endroit facilement accessible à côté du stand de l&#39;intubation. </li><li> Anesthésier la sourisen plaçant l&#39;animal dans la chambre de l&#39;isoflurane et recouvrant la chambre avec le couvercle transparent. Respecter les modes de respiration de l&#39;animal, qui sera rapide et superficielle lors de la première placée dans la chambre. L&#39;animal sera suffisamment anesthésiée quand les taux de respiration s&#39;approchent 1 souffle / 2 sec, qui est généralement atteint en 30 secondes à placer dans la chambre. La souris doit être anesthésié comme indiqué dans le protocole approuvé pour les animaux en utilisant la méthode de chute de l&#39;isoflurane. </li><li> Retirez la souris anesthésiée de la chambre et de suspendre l&#39;animal sur l&#39;intubation tenir ses incisives. S&#39;assurer que l&#39;animal est bien retenu et la bouche et la langue sont accessibles. </li><li> Garantir doucement la langue avec la pince droite. Saisir la languette avec la pince à angles et tirez-le doucement hors de la bouche jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère résistance se fait sentir. Cette action est suffisante pour bloquer l&#39;épiglotte et avoir accès à la trachée. </li><li> Tout en continuant à tenir la langue dans laposition étendue, administrer la dose de 50 ul de LPS dans le fond de la gorge et couvrir immédiatement les narines de l&#39;animal avec un doigt ganté. Le LPS sera visible à l&#39;arrière de la gorge jusqu&#39;à ce que la souris inhale. </li><li> Continuez à couvrir les narines et maintenez la langue étendu pendant 5-10 respirations supplémentaires. </li><li> Débranchez la souris de la position de l&#39;intubation et placez le dos de l&#39;animal dans une nouvelle cage jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie. </li><li> Surveillance de marqueurs de substitution associées à la progression de la maladie. Le poids corporel et la température du corps doivent être surveillés tous les 4-8 heures pour la durée de l&#39;étude. De même, évaluer les caractéristiques de comportement et de symptômes cliniques associés à une morbidité accrue. </li><li> Pour évaluer la progression de la maladie, les souris de récolte aux points de contrôle spécifiques suite à l&#39;exposition au LPS. Points de temps typiques de récolte après une exposition LPS comprennent 0, 6, 12, 18, 24, et 48 h. Pour évaluer le rétablissement et la survie, évaluer la souris pour 7 days après l&#39;inoculation. </li></ol> 2. Sérum et lavage broncho-alvéolaire fluide (LBA) Collection <ol><li> Sacrifier la souris en utilisant une méthode approuvée institutionnellement. </li><li> Placez l&#39;animal sur son dos et le fixer à un bord de l&#39;autopsie, idéalement 0,5 à (1,27 cm) de hauteur. </li><li> Mouillez l&#39;ensemble souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 27 G, procéder à une ponction cardiaque avant de faire des incisions. Il devrait être possible de retirer 500 à 800 pi de sang total à partir d&#39;une seule souris. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la seringue et transférer le sang total à un tube de 1,5 ml microtubes préalablement marqué. Pour la collecte de sérum, le sang total permet de coaguler pendant au moins 30 min à température ambiante. En plus de la collecte de sérum, ce procédé peut également être modifié par incorporation d&#39;un anti-coagulant dans le tube et d&#39;une seringue, avant de recueillir le sang entier, pour étudier les cellules immunitaires circulantes. </li><li> Faire une incision horizontale untraverser la longueur de la cavité péritonéale, et une incision verticale de la cavité peritoneale à la mâchoire inférieure de la souris. </li><li> En utilisant une pince, saisir des deux côtés de l&#39;incision et tirez doucement la peau à l&#39;écart des cavités péritonéale et thoraciques sous-jacents. </li><li> Faire une incision le long de la grande longueur de la cavité péritonéale des organes génitaux du sternum, en prenant soin d&#39;éviter de couper le diaphragme. Déplacer doucement l&#39;intestin dans la cavité péritonéale pour permettre l&#39;accès à l&#39;un des reins. </li><li> Couper la veine rénale conduisant à la rein à servir de point de perfusion de drainage. </li><li> Nick le diaphragme à l&#39;aide de ciseaux, en prenant soin d&#39;éviter les poumons et le cœur, pour exposer le côté gauche du cœur. </li><li> Perfuse manuellement le coeur à l&#39;aide d&#39;une seringue de 10 ml avec une aiguille de 27 G et une solution 1 x PBS. Éviter d&#39;appliquer une force excessive lors de la perfusion afin de s&#39;assurer que la solution saline n&#39;est pas forcé dans les poumons. Le sang restant devrait s&#39;écouler de l&#39;incision de la veine porte.</li><li> Découpez soigneusement la cage thoracique le long du sternum avec des ciseaux émoussés / émoussés, en prenant soin d&#39;éviter de couper le cœur et les poumons. Couper accidentellement les poumons au cours de cette procédure permettra de réduire considérablement la quantité de BALF recueillies et se traduira par une incapacité à gonfler correctement les poumons avec fixateur. </li><li> Isoler doucement le cœur et les poumons à l&#39;extérieur de la cage thoracique à l&#39;aide de pinces. Découpez soigneusement chaque section de la cage thoracique à l&#39;aide contondants / émoussé ciseaux à proximité de la colonne vertébrale que possible et complètement enlever les deux sections. </li><li> Séparez les glandes salivaires à l&#39;aide de forceps ou de les supprimer en utilisant des ciseaux, pour exposer la trachée. </li><li> Découpez soigneusement les muscles qui recouvrent la trachée avec des ciseaux. Il est essentiel que la trachée pas être coupé pendant ce processus. </li><li> Avec des ciseaux, séparer la clavicule recouvrant la trachée. </li><li> Saisir doucement le thymus aide d&#39;une pince et soulever le tissu du coeur. Retirez le thymus l&#39;aide de ciseaux, tout en veillant àéviter de couper le cœur ou les poumons. </li><li> Faire une petite incision horizontale dans la trachée 1-2 anneaux au-dessous du larynx à l&#39;aide des ciseaux inclinés (45-90 º d&#39;angle de, pointus / pointus). L&#39;incision doit être suffisamment grande pour fixer solidement la canule. </li><li> Insérer la canule, de sorte que l&#39;extrémité effilée s&#39;étend anneaux trachéaux 3.2 ci-dessous de l&#39;incision et de fixer la canule en place à l&#39;aide d&#39;une suture de soie. Assurez-vous que le fil de suture passe entre la trachée et l&#39;œsophage et il est tendu sur la canule. </li><li> Remplir une seringue de 1 ml avec 1 ml de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS) et introduire délicatement sa luer dans la canule. </li><li> En utilisant un mouvement lent, mais constant, injecter ~ 900 pi dans la trachée, ce qui gonfle les poumons, et de retirer immédiatement le HBSS. Placer le BALF récupéré dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Répétez cette lavage 2 fois supplémentaires pour recueillir environ 3 ml de BALF pour une analyse future. Rangez le BALF sur la glace ou à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol><ol><li> Insérer une seringue de 10 ml dans la position de gonflage du poumon. Assembler les tubes à la luer, le luer sur le robinet et le robinet de la seringue. S&#39;assurer que le robinet est en position fermée. La seringue de 10 ml servira de réservoir d&#39;écoulement par gravité. Le réservoir doit être fixé à l&#39;inflation 4,75 distingue en dessus de l&#39;animal et de la partie supérieure du réservoir doit s&#39;étendre au-dessus de 10,5 dans l&#39;animal. </li><li> Remplir la seringue avec neutre solution de formol tamponné. S&#39;assurer que la seringue est complètement remplie avec le fixateur. </li><li> Placer une serviette absorbante sous l&#39;extrémité ouverte du tube et d&#39;ouvrir le robinet d&#39;arrêt pour permettre le fixateur pour remplir le tube. Une fois le fixateur commence coule du tuyau, fermer immédiatement le robinet et remplir la seringue vers le haut avec un fixateur. Il est important que la seringue soit complètement rempli de fournir la quantité appropriée de la pression de gonflage du poumon. </li><li&gt; Passer doucement un second morceau de fil de suture sous la trachée, environ 1-2 anneaux trachéaux dessous de l&#39;extrémité de la canule. </li><li> Faire un nœud simple en vrac dans la suture; cependant, ne tirez pas sur le noeud serré. </li><li> Insérez le tube de l&#39;inflation de la souris se dans la canule. </li><li> Ouvrir le robinet et laisser les poumons se remplissent par gravité inflation. </li><li> Une fois que les poumons atteignent leur niveau de gonflage maximale, tirez le fil de suture serré et attacher un deuxième noeud. </li><li> Fermer le robinet et retirez le tube de la canule. </li><li> Retirer délicatement la canule de la trachée en saisissant le fil de suture avec une paire de pinces et en maintenant la canule avec les doigts. Tirez fermement le fil de suture vers le bas vers la cavité thoracique et la canule de retour vers le nez de la souris. </li><li> Saisir doucement la trachée ou les sutures avec une pince et soulever la trachée loin de la cavité du cou. </li><li> Couper la caudale de la trachée à la suture attaché avec des ciseaux émoussés. </li><li> Une fois que le Trachea est libre dans les tissus sous-jacents, de commencer à tirer sur la trachée à une distance à partir de la souris. Soulevez doucement les poumons de la cavité thoracique. </li><li> Découpez soigneusement le tissu conjonctif tenant les poumons dans la cavité thoracique. Continuer à tirer la trachée à distance du corps de la souris et appliquer une force constante à la hausse tout en réduisant les connexions sous-jacentes. Prenez soin de ne pas couper les poumons. Notez que le coeur doit être laissé attaché aux poumons en utilisant cette méthode. </li><li> Une fois que les poumons ont été retirés, placez-les dans 10 ml de formol tamponné. </li><li> Supprimer une section de la queue de la souris pour le génotypage. </li><li> Disposer de la carcasse de la souris suivant les directives institutionnelles appropriées. </li></ol> 4. Évaluation de cytokines <ol><li> Centrifuger le sang total, recueillis à l&#39;étape 2.5, à 12 000 g pendant 5 min à isoler le sérum. Transférer le sérum dans un tube de 1,5 ml microtubes pré-marqués et conserver à -80 ° C. </li><li> Évaluer la serum niveaux de cytokines par ELISA ou un autre test similaire. Diluer le sérum 01 heures 05-à-01:20 dans un tampon de dilution approprié, en fonction du dosage, suivant les instructions du fabricant. Ces dilutions doivent être déterminés de façon empirique avant l&#39;exécution de la masse des échantillons. </li><li> En raison du faible volume de sérum recueilli, de réduire le volume de l&#39;échantillon chargé sur la plaque ELISA de moitié. Par exemple, la plupart des tests ELISA commerciaux utilisent des volumes de 100 pi de normes et des échantillons. Pour conserver les échantillons, charge 50 pi de normes et de sérum dilué par puits. </li><li> Centrifugeuse la BALF dans une centrifugeuse de table réfrigérée à 200 g pendant 5 min. Transférer le surnageant acellulaire en deux préalablement marqué de 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li><li> Évaluer cytokines BALF par ELISA ou un autre test similaire sans diluer. </li><li> Magasin sérum utilisé et BALF à -80 ° C. </li></ol> 5. Différentiel coloration et BAL évaluation Cellularity <ol><li> Suite à la centrifugation et BALF élimination complète du HBSS, lyser les globules rouges en culot à l&#39;aide de la solution saline hypotonique. Remettre en suspension les cellules dans 900 ul d&#39;eau distillée. Immédiatement ajouter 100 ul de PBS 10x. </li><li> Lyser individuellement chaque échantillon. Si les échantillons contiennent une quantité excessive de cellules rouges du sang, les cellules peuvent être rassemblées en un culot dans la centrifugeuse de paillasse à 400 xg pendant 5 min et le sang protocole de lyse des globules rouges peut être répété. </li><li> Déterminer la cellularité totale de BALF dans la suspension de 1 ml en utilisant un hématimètre à 10X ou 20 X grossissement avec coloration au bleu Trypan. Évaluer et présenter ces données comme cellules / ml. </li><li> Préparer le matériel pour la cytospin et coloration différentielle. Étiqueter les lames de microscope standard à l&#39;aide d&#39;un crayon ou stylo solvant résistant. Fixer les lames dans une tranche d&#39;cytospin et entonnoir. Fixez l&#39;ensemble de diapositives dans le rotor de cytospin. </li><li> Cytospin 150 ul de BALF à 100 xg pendant 5 min. Si la densité cellulaire est trop grand pour effectivementévaluer la morphologie des cellules, de réduire le volume filé vers le bas sur les diapositives. Laisser les lames à l&#39;air sécher pendant la nuit. </li><li> Différentiel colorer les lames suivant les protocoles fabrique. Laisser les lames à l&#39;air sécher pendant la nuit. Les lames couvre-objet en utilisant du Permount et évaluer les lames à l&#39;aide d&#39;un microscope équipé d&#39;un objectif 20X et 40X. </li><li> Récolter les cellules restantes pour une analyse ultérieure, telles que FACS, microscopie électronique, microscopie confocale, l&#39;extraction de l&#39;ARN pour l&#39;évaluation de l&#39;expression des gènes, et / ou l&#39;extraction des protéines de transfert de western. </li></ol> 6. évaluation histopathologique <ol><li> Préparer les poumons pour l&#39;évaluation histopathologique. Après 24-48 heures de la fixation au formol, orienter le ventre les poumons entiers gonflés et inclus en paraffine. Couper les blocs qui en résultent pour exposer le principal conducteur voies respiratoires. </li><li> Pour améliorer la précision de pointage, positionner les poumons dans la même position et couper chaque bloc pour obtenir la visualisation longitudinale maximale de til intrapulmonaires principal voies respiratoires axiale. De ce point, couper 5 microns de coupes en série et la tache avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E). Des sections supplémentaires peuvent être découpés et préparés pour l&#39;hybridation in situ en utilisant des protocoles standards. </li><li> Évaluer l&#39;histopathologie l&#39;aide d&#39;un système de notation semi-quantitative basée sur les paramètres inflammatoires suivantes, qui sont notés entre 0 (absent) et 3 (sévère): mononucléaires et polynucléaires infiltration de cellules; des voies respiratoires hyperplasie des cellules épithéliales et des blessures; extravasation; périvasculaire et menottes peribroncheolar; et le pour cent du poumon associé à une inflammation. Poumon histopathologie doit être évaluée par un pathologiste expérimenté. </li><li> Moyenne de l&#39;ensemble des scores de paramètres pour générer un score total de l&#39;histopathologie ou utiliser scores individuels de quantifier les aspects spécifiques de la progression de la maladie. Effectuer tous notation dans un mode à double insu, avec les examinateurs en aveugle à la fois le génotype et le traitement. Ce système de notation a été previously décrit 6,7,10. </li></ol>

<ol>
	<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report:+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals.">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis.">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+NLRP3+in+the+development+of+allergic+airway+disease+in+mice.">Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice.</a> J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+NPSR1/GPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease.">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).</li><li>Kebaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+mediates+virulence+in+a+murine+model+of+severe+pneumonia+through+activation+of+the+NLRP3+inflammasome.">Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome.</a> J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).</li><li>Roberts, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+murine+immune+response+to+pulmonary+delivery+of+precisely+fabricated+nano-+and+microscale+particles.">Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Willingham, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(NALP3,+Cryopyrin)+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation,+necrosis,+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways.">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li><li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide.">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li><li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice.">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes les plus critiques pour l&#39;évaluation avec succès la réponse immunitaire de l&#39;hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d&#39;évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l&#39;évaluation histopathologique. Le choix de la souche de souris est un facteur important da...

Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l&#39;hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l&#39;impact de ces infections. L&#39;objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l&#39;utilisateur une méthode flexible pour évaluer l&#39;hôte réponse immunitaire innée à l&#39;infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l&#39;agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut pour les bactéries vivantes. La majorité des études antérieures évaluant l&#39;hôte réponse immunitaire innée aux bactéries ont mis l&#39;accent sur les modèles péritonéale en raison de la relative facilité d&#39;exécution. Bien que ces modèles sont très utiles et ont donné lieu à des avancées significatives dans le domaine des interactions hôte-pathogène et l&#39;inflammation systémique, les données générées à partir de ces modèles ne sont pas toujours appropriés pour les études involving le système respiratoire. Ici, un modèle d&#39;inflammation pulmonaire aiguë du poumon est proposé comme une extension pratique et cliniquement pertinente de l&#39;intra-péritonéale (ip), les modèles d&#39;injection classiques. La technique proposée permet l&#39;évaluation locale de la réponse immunitaire innée dans un système de modèle spécifique d&#39;organe. Les méthodes décrites ici sont conçues pour fournir une technique simple et robuste pour permettre aux utilisateurs d&#39;évaluer la réponse immunitaire de l&#39;hôte au LPS, qui est un PAMP commun. Les méthodes sont basées sur intratrachéale (it) instillation de LPS, ce qui induit une réponse immunitaire innée robuste dans les poumons de souris et imite de nombreuses caractéristiques physiopathologiques observés chez des patients humains souffrant d&#39;infections respiratoires et de lésions pulmonaires aiguës 1. Un avantage principal de cette technique est qu&#39;elle permet à l&#39;utilisateur d&#39;évaluer la réponse immunitaire de l&#39;hôte sans les facteurs de confusion et des problèmes de sécurité liés à la réalisation des études in vivoà l&#39;aide de bactéries vivantes. De même, l&#39;administration de ce parcours oropharyngée de l&#39;exposition décrite dans ce protocole présente des avantages significatifs par rapport aux autres techniques couramment utilisées, y compris par voie intranasale (dans) l&#39;administration et la gestion de ce chirurgical. Par exemple, l&#39;administration du dosage, il permet oropharyngée relativement précise et dépôt dans les poumons, comparativement à l&#39;administration, qui souffre généralement d&#39;une augmentation de la variabilité de dépôt dans les poumons à cause de la perte d&#39;agents dans la cavité nasale, des sinus de 2-4. La voie d&#39;administration de ces cavités, il contourne et permet un accès direct à la trachée et les voies respiratoires. De même, l&#39;approche chirurgicale est une méthode d&#39;administration beaucoup plus morbide et nécessite une formation approfondie à maîtriser. Les protocoles décrits ici comprennent également une description des techniques courantes et des marqueurs de substitution utilisés pour évaluer la progression de l&#39;inflammation et se terminer par un protocole décrivant les techniques appropriées pour la préparation de la luNGS pour l&#39;évaluation de l&#39;histopathologie. Ces protocoles sont concentrés sur la réduction du nombre de souris requis pour chaque étude en maximisant les données générées à partir de chaque animal individuel. Les protocoles décrits sont très flexibles et peuvent être facilement modifiés pour évaluer une diversité PAMP de gamme et des modèles moléculaires de dommages associé (atténue). En outre, moyennant quelques modifications supplémentaires, ces protocoles peuvent également être appliqués à des études évaluant allergique des voies aériennes progression de la maladie ou des interactions hôte-pathogène avec des bactéries vivantes, des virus ou des champignons 5-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

La réponse immunitaire de l&#39;hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d&#39;injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d&#39;interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d&#39;inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l&#39;hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d&#39;administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d&#39;utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l&#39;hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l&#39;étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l&#39;inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.

Les parois cellulaires des bactéries Gram-négatives sont constituées de LPS, ce qui est très abondant dans l&#39;environnement. L&#39;inhalation de LPS dans les populations humaines sensibles exacerbe réactivité des voies respiratoires et est capable de déclencher une response11 immunitaire robuste. LPS est également un PAMP commun utilisé dans des modèles de souris pour induire une réponse immunitaire innée robuste. Dans le protocole décrit ici, les souris ont reçu une dose de LPS il isolé de E. coli...

Watch this Scientific Journal Video about The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice at JoVE.com

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

La réponse immunitaire de l&#39;hôte à l&#39;infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d&#39;exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K vues.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie. 

Vidéo: The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Recherche

Immunologie et infection

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Une introduction à guêpes parasites<em&gt; Drosophila</em&gt; Et la réponse immunitaire antiparasitaire

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d&#39;Innate Immune Health chez le poisson zèbre

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

inoculant<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Les moustiques avec perles à induire et mesurer la réponse immunitaire mélanisation

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l&#39;infiltration cellulaire inflammatoire

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.