L’objectif global de ce protocole est de caractériser biochimiquement l’activité de transferase tRNA-Isopentenyl in vitro. Cette méthode est utile pour la détection in vitro et la caractérisation de l’activité de transferase tRNA-isopentenyl des enzymes recombinantes purifiées. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un essai simple et direct utilisé pour détecter une modification covalente de l’ARN.
Bien que cette méthode donne un aperçu de l’activité de transferase tRNA-isopentenyl, elle est potentiellement adaptable pour la caractérisation biochimique d’enzymes modificables à large portée ou arn. La première étape de cette procédure consiste à nettoyer soigneusement les plaques de verre qui seront utilisées pour moulage du gel. Laver les assiettes avec du savon et de l’eau, bien rincer à l’eau déionisée, puis nettoyer les assiettes avec des lingettes sans isopropanol et sans peluche.
Ensuite, assemblez les plaques et les entret spatiales. Mélanger les reagents suivants pour faire un 100 millilitres 20% acrylamide, 7,5 urée molaire, 1x gel TBE. 80 millilitres de concentré de gel d’urée, 10 millilitres de gel d’urée diluant, et 10 millilitres de tampon gel d’urée.
Ajouter 40 microlitres de T-med et 800 microlitres de persulfate de 10% ammonium fraîchement préparé au mélange. Dessinez la solution de gel dans une grande seringue et distribuez la solution de gel entre les plaques de verre tapant sur le verre tout en distribuant la solution pour empêcher la formation de bulles. Laisser le gel se solidifier à température ambiante pendant 30 minutes.
Une fois le gel solidifié, plantez le gel sur un appareil de gel vertical. Remplissez les chambres tampons supérieures et inférieures de 1x TBE. Deux heures avant le chargement du gel, pré-exécuter le gel à 20 milliamps pendant deux heures pour permettre à la limite tampon de sortir les plus petits oligonucléotides.
Préparez chaque réaction pour l’essai d’isopentenylation d’ARN dans un volume final de 17 microlitres. Ajouter à chaque tube 50 millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 millimolar ATP, chlorure de magnésium de 5.8 millimlaire, 0.2 millimolar DMAPP, inhibiteur de 10 unités de RNase, 40.000 CPM interne 32P étiqueté ARN, 5.3 micromolar Mod5, et 1.2 millimolar 2-mercaptoethanol. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Après une heure, l’éthanol précipite le RNase en utilisant 2,5 volume de 100% éthanol et 1/10 volume de 3,5 molaire de pH d’acétate de sodium 5,5, et le placer négatif 20 degrés Celsius pendant une heure pendant la nuit. Ensuite, centrifugeuse les échantillons d’ARN à 15, 400 g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirez soigneusement le supernatant et lavez chaque granulé d’ARN avec 500 microlitres de 70 % d’éthanol.
Centrifuger les échantillons à 15, 400 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirer délicatement le surnatant et sécher à l’air les granulés d’ARN pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé. Ensuite, suspendez chaque granulé d’ARN dans 10 microlitres de huit urée molaire.
Ajouter 150 unités de RNase T1 à chaque échantillon et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajouter deux microlitres de tampon de chargement 6x à chaque échantillon. Chargez 10 microlitres de chaque échantillon d’ARN sur un gel d’urée pré-exécuté, 20% polyacrylamide, 7,5 molaires d’urée.
Faire fonctionner le gel à 25 milliamps pendant deux heures. Après deux heures, arrêter l’électrophorèse et retirer le gel de l’appareil. Casser le joint entre les deux plaques de verre et retirer soigneusement l’une des plaques de verre avec le gel restant sur l’une ou l’autre plaque.
Placez une couche de pellicule plastique sur le gel et exposez-la sur un écran de phosphore pendant trois heures. Ce protocole détecte de manière fiable l’isopentenylation des résidus canoniques et noncanoniques d’ARN modifiés par le Mod5 d’isopentenyl d’isopentenyl de S.cerevisiae. Dans cet exemple tyrosine tRNA a été étiqueté à l’interne avec 32P-adénosine et Mod5 a été incubé avec RNase en présence ou en l’absence de DMAPP.
Les ARN ont été digérés avec RNase T1 et résolus sur un gel de polyacrylamide dénaturant. Mod5 modifie le résidu prévu en présence de DMAPP et indiqué par le nucléotide décalé de 10, triple adénosine contenant le fragment aux positions nucléoside 36 à 38 contiennent le fragment dans le tRNA de tyrosine. L’adénosine modifiée 37 réside est indiquée avec un astérisque.
De même, lorsque l’ARN trine est incubé avec Mod5 et DMAPP, un décalage complet de l’adénosine triple nucléotide contenant du fragment à la position nucléoside 36 à 38 est observé. Fait intéressant, on observe un déplacement partiel d’un fragment de sept nucléotides qui ne contient pas le triple adénosine contenant du fragment aux positions nucléoside 36 à 38, ce qui suggère que le triple adénosine contenant du fragment à la position nucléoside 36 à 38 séquence et structure peut ne pas être nécessaire pour l’activité in vitro mod5. Une fois maîtrisée, cette technique prendra deux, quatre à six jours d’heure si elle est effectuée correctement.
Bien essayer cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir et de surveiller l’intégrité de l’ARN, parce que la dégradation de l’ARN pourrait effectuer la modification de l’ARN et confondre l’interprétation des données. Suite à cette procédure des études mutationnelles en utilisant votre enzyme d’intérêt, pourrait être fait pour déterminer les résidus spécifiques ou les domaines nécessaires pour l’activité enzymatique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN, pour dire les activités de transferase tRNA-isopentenyl des enzymes procaryotes et eucaryotes.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le protocole pour la détection de l’activité de transferase isopentenyl de votre enzyme d’intérêt. N’oubliez pas que le travail avec la radioactivité peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le port d’epi approprié, l’utilisation d’un blindage adéquat, et l’élimination de la radioactivité correctement devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
