La triphosphorylation est une modification 5'omniprésente de l’ARN en biologie et est de plus en plus utilisée dans les applications biotechnologiques. Le protocole décrit ici permet la triphosphorylation 5' de tout oligonucléotide préparé par synthèse automatisée standard. La triphosphorylation chimique agit sur des oligonucléotides contenant de l’ARN, de l’ADN ou de l’acide nucléique non naturel.
Ici, l’ARN L gaucher triphosphorylé, l’énantiomère de l’ARN D biologique, est synthétisé purifié et utilisé dans une réaction ribosome. La triphosphorylation est réalisée après la synthèse automatisée des oligonucléotides et avant la déprotection. Ces étapes ne sont pas montrées ici, mais les chercheurs doivent être familiers avec les méthodes standard pour les deux.
Pour commencer, assurez-vous que l’espace de travail pour la phosphorylation dispose d’un collecteur de gaz avec au moins deux lignes et que le barboteur est relié à une source d’argon sec avec une pression réglable car la réaction de triphosphorylation doit être effectuée sous argon. Fixez ensuite une seringue en plastique millilitre aux lignes pour faciliter la connexion à l’appareil de réaction. Ensuite, collectez l’équipement, y compris des seringues en plastique d’un millilitre, un robinet d’arrêt en polypropylène à trois voies, des aiguilles non toniques, des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre, une petite spatule métallique et conservez-les dans un récipient scellé ou un dessiccateur avec un dessicant à température ambiante pendant au moins un jour avant utilisation.
Sous pression d’argon, retirer 30 millilitres de 1,4-dioxane anhydre d’une bouteille scellée. Transférer dans une bouteille en verre séchée de 30 millilitres et ajouter un piège à séchage. Sceller avec des septa en caoutchouc et stocker dans un dessiccateur avec un dessicant.
De même, préparer 30 millilitres de N, N-diméthylformamide, acétonitrile et le mélange de trois parties de dioxane et d’une partie de pyridine en volume. Préparer la solution tbap en mélangeant du pyrophosphate de tributylammonium solide avec du diméthylformamide et de la tributylamine dans une bouteille en verre de 30 millilitres comme décrit dans le manuscrit. Ajoutez trois pièges de dessin.
Scellez la bouteille avec un septum en caoutchouc sous argon et bullez avec de l’argon pendant 30 minutes. Après avoir préparé un oligonucléotide avec un 5'hydroxyle libre sur une colonne de synthèse à l’aide d’un synthétiseur ADN/ARN automatisé. Préparez la chambre en retirant le piston d’une seringue sèche d’un millilitre.
Coupez le haut de la seringue à l’aide de ciseaux ou d’une lame de rasoir et fixez la seringue à la colonne de synthèse. Sur le dessus de la seringue, fixez le robinet d’arrêt à trois voies et fixez l’entrée latérale du robinet d’arrêt à la source d’argon sec avec le barboteur de sorte que l’entrée supérieure du robinet d’arrêt agisse comme l’orifice d’injection du réactif. Fixez ces opérateurs à un support avec des pinces et scellez tous les joints en amont avec un film d’étanchéité à la cire.
Ajustez ensuite le robinet d’arrêt de sorte que l’orifice d’injection soit fermé et que l’appareil soit ouvert à la source d’argon. Fermez le barboteur et laissez l’argon à basse pression s’écouler dans la chambre d’action pendant cinq minutes. Après avoir rouvert le barboteur, fixez une seringue au bas de la colonne de synthèse, qui sera la seringue à déchets.
Ensuite, tirez l’argon à travers la colonne à plusieurs reprises à l’aide de la seringue à déchets, puis reconnectez la seringue avec le piston enfoncé complètement. Pour ajouter un réactif ou un solvant, fixez une aiguille à la source d’argon sec et insérez-la dans le septum du réactif ou de la bouteille de solvant, en prenant soin de ne pas immerger l’aiguille dans le contenu de la bouteille. Ensuite, assemblez une seringue sèche avec une aiguille et insérez-la dans le septum du réactif ou du flacon de solvant sans l’immerger dans le contenu du flacon.
Ensuite, remplissez la seringue d’argon, retirez l’aiguille du septum et expulsez l’argon. Après avoir rempli la seringue d’argon et expulsé une fois de plus, remplissez la seringue avec le volume requis de solvant ou de réactif sous pression d’argon. Ajustez le robinet d’arrêt pour que la source d’argon soit fermée et que le port d’injection soit ouvert.
Une fois que l’arrêt de l’appareil est réglé rapidement, retirez la seringue et l’aiguille remplies du flacon source, essuyez tout solvant collé sur le côté ou à l’extrémité de l’aiguille, puis insérez l’aiguille dans le port d’injection. Après avoir expulsé un réactif dans l’anti-chambre des opérateurs, retirez l’aiguille et fermez l’orifice d’injection tout en rouvrant l’appareil à la source d’argon. Aspirez doucement le liquide de l’anti-chambre tout au long de la colonne de synthèse à l’aide de la seringue à déchets afin que tout le liquide soit maintenant maintenu dans la seringue à déchets.
Maintenant, repoussez lentement la solution dans la colonne de synthèse, en vous assurant qu’aucune bulle de gaz n’est dans la colonne. Pour mélanger ou agiter, tirez doucement la solution de haut en bas sur la colonne avec la seringue à déchets. Pour retirer un réactif ou un solvant de la colonne, tirez lentement la solution dans la seringue à déchets.
Une fois que la majeure partie de la solution est passée dans la seringue à déchets, tirez l’argon pour rincer le solvant restant de la colonne. Ensuite, retirez le film d’étanchéité à la cire autour du joint de la seringue à déchets. Retirez ensuite la seringue et jetez la solution de déchets.
Ensuite, remplacez la seringue usagée par une nouvelle seringue sèche et refermez le joint. Après avoir assemblé l’appareil de triphosphorylation, commencez la réaction de triphosphorylation en ajoutant 200 microlitres de dioxane de pyridine à l’anti-chambre, comme démontré précédemment. Mais ne tirez pas encore l’échantillon sur la colonne de synthèse.
Après avoir dissous le SalPCl dans le dioxane comme décrit dans le manuscrit, ajoutez-le à l’anti-chambre et chargé sur la colonne de synthèse à l’aide d’une seringue sèche. Ensuite, laissez-le réagir pendant 15 minutes, puis retirez et jetez la solution de SalPCl à l’aide d’une seringue à déchets comme démontré précédemment. Immédiatement après avoir retiré la solution salPCl, ajouter 250 microlitres de solution TBAP à l’anti-chambre et chargé sur la colonne de synthèse.
Laissez-le réagir 20 minutes avec agitation et jetez comme décrit précédemment. Ensuite, lavez la colonne avec 0,5 millilitre de N, N-diméthylformamide, puis 0,5 millilitre d’acétonitrile, en retirant le solvant après chaque addition. Après avoir ajouté une solution comburante, l’avoir retirée et avoir lavé à nouveau la colonne avec de l’acétonitrile en utilisant la même procédure que celle indiquée, démonter l’appareil et laver la colonne avec cinq millilitres d’acétonitrile.
Ensuite, séchez la colonne. Coupez l’oligonucléotide triphosphorylé du support solide et déprotégez-le à l’aide de protocoles standard décrits dans le manuscrit. Ensuite, dissoudre l’oligonucléotide déshydraté déprotégé dans un tampon de charge d’urée, chauffé à 80 degrés Celsius, puis charger sur un gel de polyacrylamide et fonctionner pendant une à deux heures à 25 à 35 watts.
À la fin de l’électrophorèse sur gel, après avoir retiré la plaque de gel, démontez-la et enveloppez le gel dans un film de polychlorure de vinyle. Ensuite, identifiez les bandes de produits en ombrage arrière avec une lumière UV de 254 nanomètres et éliminez la bande de produit principale à l’aide d’une lame de rasoir. Écrasez le gel excisé en l’extrudant à travers une seringue en plastique ou mécaniquement.
Pour les oligonucléotides de moins de 15 nucléotides, éluez dans trois fois le volume de gel de l’eau libre de nucléase pendant au moins 12 heures avec agitation ou agitation. Ensuite, retirez les morceaux de gel solides en faisant passer la solution à travers une seringue équipée d’un filtre de 0,2 micromètre et concentrez-la par lyophilisation. Après la concentration, éliminer les sels résiduels et les saluts à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille jetable et concentrer par lyophilisation comme démontré précédemment.
Après avoir préparé 10 microlitres d’une solution d’ARN contenant du ribozyme de polymérase et un gabarit d’amorce d’ARN-L et des trinucléotides triphosphates tels que décrits dans le manuscrit, recuites-les en les chauffant à 90 degrés Celsius pendant une minute et en les refroidissant à 23 degrés Celsius à 0,2 degré Celsius par seconde dans un thermocycleur PCR. Après avoir incubé la solution d’ARN à 17 degrés Celsius, arrêtez la réaction en ajoutant 10 microlitres de deux fois la concentration du tampon de départ au fur et à mesure que la réaction se poursuit, prenez 10 aliquotes de microlitres et éteignez avec cinq microlitres d’EDTA 0,5 molaire à pH 8 et traitez chaque échantillon pour isoler l’ARN comme décrit dans le manuscrit. Dissoudre l’ARN précipité dans 10 microlitres de tampon de chargement de gel formalisé et préparer un apprêt marqué à l’extrémité non réagie comme décrit dans le texte.
Une fois les échantillons préparés, chauffer à 80 degrés Celsius. Chargez cinq microlitres de l’échantillon dans chaque puits et faites fonctionner le gel à 40 watts pendant environ 40 minutes. Après avoir retiré la plaque de gel du support, scannez à l’aide d’un scanner de gel fluorescent ou phosphorescent pour visualiser les produits d’extension de l’ARN L chiral croisé.
Après la purification du gel, l’ombrage uv révèle la présence de 5'triphosphate en tant que produit majeur unique, comme indiqué pour les trimères d’ADN AAA et CCC et le trimère d’ARN L GAA. Le produit secondaire 5'hydroxyle est souvent visible comme une bande de migration plus lente, qui a été isolée et identifiée par spectrométrie de masse pour les trimères d’ADN. Des bandes supplémentaires pendant la purification du gel sont en corrélation avec les produits secondaires 5'diphosphate, monophosphate et H-phosphonate en spectrométrie de masse des produits de réaction non purifiés.
Les produits 5'triphosphate présentent un pic massique primaire correspondant au 5'triphosphate ainsi qu’aux masses 5'di et monophosphate. Des trinucléotides d’ARN-L chimiquement liés au triphosphate ont été utilisés avec un amorce d’ARN-L et un modèle d’ARN-L dans une réaction de polymérisation de l’ARN analysée par PAGE et imagée à l’aide d’un scanner de gel fluorescent. Le produit étendu marqué par des cercles noirs a démontré la synthèse d’une version L-ARN du ribozyme à tête de marteau codée par le gabarit.
L’exposition à l’eau pendant la triphosphorylation réduira le rendement. Suivez les étapes de préparation des réactifs secs et d’assemblage minutieux de l’appareil de réaction. Déplacez lentement les fluides à travers l’appareil pour éviter la rupture des joints.
La triphosphorylation chimique est essentielle à la préparation de triphosphates oligonucléotidiques non biologiques, y compris l’ARN gaucher. Cela a permis la synthèse croisée du ribozyme chiral des versions d’image miroir des molécules d’ARN trouvées en biologie.
