Nous remercions Shlomi Krispin pour l&#39;image du tube neural. En particulier, nous reconnaissons Yuval Cannelle pour l&#39;ouverture de la technique de transfection GFP. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation d&#39;Israël Science, Association Française contre les Myopathies ERP, et Forschungsgemeinshaft Deutche, Collaborative Research Centre 488 à CK

1. Préparation des micropipettes Nous tirons nos pipettes sur une norme Narishige extracteur PP-83 pipettes avec un réglage de chaleur de 13,5. Le réglage précis doit être calibré, visant à une extrémité de la pipette de diamètre compris entre 8 et 10 microns. Nous utilisons des filaments des tubes contenant de verre borosilicate avec un diamètre extérieur de 1,0 mm et diamètre intérieur de 0,75 à 0,78 mm d&#39;. Les pipettes sont donc stockés dans un récipient en plastique avec les bouts protégés de tout contact avec les bords du plat. 2. Préparation d&#39;ADN Le plasmide d&#39;intérêt est transfectée dans DH5a E. coli en utilisant des procédures standard. Nuit à partir de cultures colonies isolées sont utilisées pour purifier le plasmide à l&#39;aide maxi-prep kits (aucun kit commercial devrait faire). Nous utilisons une concentration plasmidique de 1,0 ug / uL pour les non-clonale injections. Des concentrations plus élevées augmentent le colmatage des embouts de pipette. Pour les applications clonale, les concentrations de plasmide sont beaucoup plus bas et doivent être ajustés (voir ci-dessous). Pour pCAGG-GFP, la concentration optimale des résultats clonale a été retrouvé à environ 0.05 à 0,1 pg / pl. Un à 2 pi de plasmide est généralement utilisé par expérience, et une quantité minime de fast-vert en poudre (adhérant à la pointe d&#39;un sec, pipette en verre tranchants) est ajouté au plasmide avant le début de l&#39;expérience. Le plasmide est ensuite centrifugé dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 minutes à vitesse maximale. Cette procédure semble réduire pipette problèmes de colmatage. 3. L&#39;injection d&#39;embryons 3.1 Préparation des embryons Nous utilisons les cailles ainsi que des oeufs de poule pour les injections. Les œufs sont incubés mentir sur leur axe long jusqu&#39;au stade désiré de développement. Les œufs sont tamponnées avec de l&#39;éthanol 70% et on laisse sécher. L&#39;extrémité pointue de l&#39;œuf est percé de ciseaux chirurgicaux (ce qui n&#39;est nécessaire que dans des oeufs de poule) et 1 ml (en cailles) ou 2 ml (poussins) de l&#39;albumine est tiré de l&#39;œuf avec une seringue de 10 ml (19G aiguille). Les trous sont ensuite scellés avec de la paraffine chaude. Avant l&#39;injection réelle, une fenêtre est ouverte dans le haut de la coquille d&#39;oeuf à l&#39;aide des ciseaux chirurgicaux. Placer du ruban adhésif sur la coque et la coupe à travers elle peut aider à réduire les débris de la coquille. Tampon PBS contenant des antibiotiques est pipeté immédiatement dans l&#39;œuf. Pour accéder à l&#39;embryon, la vitelline et / ou membranes amniotiques sont coupés et détourné en utilisant 0,14 mm broches insectes monté sur un porte-aiguille. Encre non toxique (Pélican # 17) est injecté sous le blastoderme pour aider à visualiser l&#39;embryon, à l&#39;aide d&#39;un feu tiré par capillarité monté sur un aspirateur. 3.2 Chargement et montage de micropipettes Les micropipettes extracteur peut être chargé avec le plasmide par le feu tirés par des capillaires de diamètre adéquat, monté sur un aspirateur. Une quantité minimale de plasmide est établi en utilisant les capillaires et chargé dans la pipette de son contraire l&#39;ouverture à la pointe aiguisée, et, s&#39;approchant de la pointe de l&#39;intérieur autant que possible. La pipette est par conséquent chargé sur une pression d&#39;air injecteur manuel monté sur un micromanipulateur. Pression minimale est appliquée, si nécessaire, afin de permettre à la solution plasmidique pour atteindre la pointe de la pipette. 3.3 injection de plasmides La pipette est manipulé dans le milieu liquide de l&#39;œuf tout en appliquant une certaine pression de l&#39;air pour éviter le colmatage de l&#39;extrémité de la pipette. Le domaine des tissus concernés est percée. Le changement de pression que la pointe pénètre dans le tissu est souvent suffisant pour libérer plasmide avec le vert rapide visible. Si ce n&#39;est pas le cas, appliquez une légère pression à la seringue jusqu&#39;à ce que le plasmide verte / rapides sont éjectés. Ce processus peut être répété sur l&#39;axe de l&#39;embryon, par exemple dans les somites adjacents ou le long de la mesure du tube neural. Après les injections, PBS peut être ajouté. La fenêtre est scellée à l&#39;aide de ruban gommé (parafilm n&#39;est pas souhaitable, surtout pour les oeufs de caille-il augmente le taux de mortalité embryonnaire, probablement en bloquant l&#39;échange de l&#39;oxygène à travers la coque). Les embryons traités sont retournés dans un incubateur. Éviter la ventilation et le lieu de petits contenants avec de l&#39;eau dans l&#39;incubateur, car ils aident à maintenir l&#39;humidité et des rendements augmenter. 4. Réglage des paramètres d&#39;injection et de surveillance Taux de réussite Asessing et calibrer les paramètres d&#39;injection différents est essentielle pour les applications visant à une seule cellule d&#39;analyse. Pas tous les cas d&#39;injection va conduire à l&#39;étiquetage de succès d&#39;une seule cellule. Concentration de plasmide qui est trop élevée peut conduire à la non-clonale étiquetage, tout en très faible concentration dans la suite des taux d&#39;échec élevé. La concentration du plasmide injectée doit être optimisé pour des injections clonale. Nous vous recommandons de dilution de la totalité du stock plasmide purifié plutôt que de diluer preps individu à une concentration pré-déterminée. Ce dernierpourrait introduire une certaine variation des taux de réussite, probablement en raison de variations dans la pureté et d&#39;autres paramètres tels que la proportion de plasmide superenroulé. 4.1 Évaluer les taux de réussite par le mont d&#39;observation toute L&#39;évaluation initiale des embryons injectés peuvent être effectuées par l&#39;ensemble de montage observation sous la loupe binoculaire fluorescentes. Six à huit heures après l&#39;injection sont suffisantes pour évaluer les taux de réussite avec une construction GFP-pCAGG améliorée. Ceci est fourni sur le site cible est superficielle suffit pas d&#39;être évidente (par exemple le somite dorsal, dorsale du tube neural, etc ectoderme, voir la figure 1A-C.). Cette étape est particulièrement utile pour évaluer les séries expérimentales montrant soit trop grand nombre de cellules marquées ou, alternativement, dépourvu de toute les cellules fluorescentes. Si l&#39;incubation supplémentaire est souhaitée, les antibiotiques contenant une solution de PBS devrait être ajouté à l&#39;œuf après le visionnement et la bande d&#39;étanchéité doit être remplacée. 4.2 Évaluation par clonalité série-section de l&#39;analyse Le meilleur moyen pour évaluer le taux de succès des injections est de série de sectionnement embryons injectés et en utilisant l&#39;immunohistochimie de visualiser les cellules marquées. Dans ces conditions, les temps d&#39;incubation peut être aussi court que 4 heures après l&#39;injection. Les embryons sont fixées et traitées pour la coupe de paraffine (ou cryosectioning). Verre-sections sont ensuite montées de-paraffinées et immuno-colorées pour la visualisation journaliste. Méthodes d&#39;amplification telle que la biotine-streptavidine pourrait être souhaitable. Enfin, les sections de série sont scannés pour détecter les cellules marquées dans les segments injecté. Si, lors des premiers essais multiples plutôt que des cellules individuelles sont obtenus, le stock de plasmide doit être dilué et le processus répété jusqu&#39;à ce que des résultats satisfaisants sont obtenus. Deux à 10 dilutions de la solution stock plasmide peut être nécessaire en cas de taux de réussite étant trop élevé. Pour chaque plasmide à transfecter, une calibration complète qui assure la clonalité doit être répété. 5. Les résultats représentatifs Nous généralement effectuer une seule injection de pCAGG-GFP par somite, tout en ciblant les segments 6-12 par embryon 1 2. Sous ce réglage, un signal clair peuvent être détectées par l&#39;observation monter toute injection 8 heures après, dans au moins un segment d&#39;un embryon sur dix. Dans ces conditions, l&#39;étiquetage a été confirmée à clonale (figure 1B, C). Lors de l&#39;utilisation des concentrations d&#39;ADN élevé, la plupart des embryons peuvent présenter au moins une injection réussie, soulevant la possibilité que plusieurs cellules ont été transfectées. L&#39;analyse a révélé que la section de série transfections clonale ont été atteints lorsque le taux de réussite était d&#39;environ 10%. Cela signifie que pour atteindre clonalité, la technique est par définition, très inefficace. D&#39;autre part, dans ces conditions, plus de 93% des événements ont été trouvés étiquetage positif à une clonale. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Clonale des injections pCAGGS-GFP en progéniteurs neuronaux et squelettiques. (AC) Les sections transversales montrant l&#39;étiquetage du tube neural dorsal (NT) (A), le domaine de l&#39;ventrolatérale dermomyotome (DM) (B), ou central feuille de DM (C) , 6 heures après la micro-injection d&#39;pCAGGS-GFP à un ancêtre unique. (D) Deux jours après transfection clonale de la centrale SM, progéniteurs seule généré des dérivés dans les deux derme (D) ainsi que du muscle (M) (voir réf. 1 pour les détails).

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

La méthode décrite ci-dessus est une modification d&#39;une technique décrite précédemment pour livrer les colorants lipophiles sous-ensembles à petites cellules ou des progéniteurs unique 3. Il a trois avantages principaux sur la technique d&#39;électroporation standard. Premièrement, elle fournit un moyen pour le marquage avec des sites de confiance discrète dans les tissus cibles, ce qui permet beaucoup plus grande résolution spatiale que l&#39;électroporation (voir par exemple la figure 1B, C)...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

Un thème central en biologie du développement est la diversification des lignées et l&#39;élucidation des mécanismes sous-jacents moléculaire. Ceci implique une analyse approfondie des destins des cellules individuelles dans des conditions normales et expérimentales. À cette fin, les méthodes de transfection qui ciblent des progéniteurs simples sont une condition préalable. Nous décrivons ici une méthode techniquement simple pour la transfection des cellules individuelles dans les tissus de poulet in ovo, permettant la lignée fiables traçage ainsi que la manipulation génétique. Domaines spécifiques de tissus sont ciblés dans le somite ou du tube neural, et l&#39;ADN est injecté directement dans l&#39;épithélium de l&#39;intérêt, résultant de la transfection de cellules sporadiques unique. L&#39;utilisation des journalistes, des populations clonales peuvent par conséquent être tracée pour un maximum de trois jours, et le comportement des organismes génétiquement manipulés populations clonales peuvent être comparées à celles des contrôles. Cette méthode tire avantage de l&#39;accessibilité de l&#39;embryon de poulet ainsi que des outils émergents pour la manipulation génétique. Nous comparons et discutons de ses avantages sur la méthode d&#39;électroporation largement utilisé, et les applications possibles et l&#39;utilisation dans d&#39;autres modèles in-vivo sont également suggérées. Nous préconisons l&#39;utilisation de cette méthode comme un ajout important et se complètent pour la lignée actuelle des outils de traçage et d&#39;interférence génétique.

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Single Cell Transfection in Chick Embryos

Utiliser pointe fine micropipettes nous injectons ADN plasmidique dans les sous-domaines de somites de poulet ou de tubes neuraux. La concentration du plasmide est ajustée pour produire seule des cellules transfectées. Nous avons ensuite permettre aux cellules de se développer en des populations clonales.

La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K vues.  Hadassah Medical School - Hebrew University. Utiliser pointe fine micropipettes nous injectons ADN plasmidique dans les sous-domaines de somites de poulet ou de tubes neuraux. La concentration du plasmide est ajustée pour produire seule des cellules transfectées. Nous avons ensuite permettre aux cellules de se développer en des populations clonales.

Vidéo: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Recherche

Biologie

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

En électroporations Ovo d&#39;embryons au stade de poulet 10 HH

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Enregistrements aspiration simple cellule à partir de cônes photorécepteurs de la souris

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...