En médecine régénérative, un protocole robuste de différenciation des cellules souches pluripotentes vers un type spécifique de cellules neurales est un outil précieux. Dans notre cas, ces protocoles étaient très utiles pour étudier à la fois le développement du glioblastome et la maladie de Parkinson. Ainsi, tout d’abord, la génération d’organoïdes tridimensionnels a l’avantage d’imiter étroitement le développement physiologique, et aussi la production de néurosphères calibrées de taille à partir de cellules souches pluripotentes a une reproduction élevée.
La procédure suivante sera démontrée par Manon Locatelli, doctorante de notre laboratoire. 24 heures avant de commencer la culture en trois D, remplacez le milieu hESC par un milieu sans sérum complété par un inhibiteur rock de 10 micromolaires. Les cellules doivent être à 60% confluency.
Le lendemain, détachez les colonies hESC en tant que cellules individuelles en enlevant le milieu et en rinçant avec du calcium et du PBS sans magnésium. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de solution de dissolution enzymatique et incubez à 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Ensuite, recueillir les cellules dans le milieu sans sérum avec inhibiteur rock 10 micromolaire et centrifuger les cellules à 300 fois g pendant cinq minutes.
Après centrifugation, vérifiez la taille de la pastille cellulaire. Enlevez le supernatant et comptez les cellules en 10 millilitres de milieu sans sérum complété par un inhibiteur rock de 10 micromolaires. En parallèle, rincer la plaque de microwell avec deux millilitres de milieu sans sérum par puits et centrifuger la plaque à 1 200 fois g pendant cinq minutes pour enlever toutes les bulles afin d’empêcher la formation de neurosphère.
Ensuite, préparez 28,2 millions de cellules dans 12,5 millilitres de milieu sans sérum complété par un inhibiteur rock de 10 micromolaires. Distribuez 1000 cellules par microwell. Centrifugez les cellules à 300 fois g pendant cinq minutes et vérifiez la repartition homogène des cellules dans la plaque de microwell sous un microscope.
Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, examinez la plaque de microwell pour vérifier la taille des sphères formées dans chaque microwell. Transférer les sphères dans une assiette de six puits à l’aide du milieu complété par un cocktail d’inhibition dual-SMAD pour favoriser l’induction neuronale rapide.
De ce pas en avant, les sphères sont cultivés en rotation à 60 rpm pour les empêcher de coller ensemble ou à la plaque. Le premier au quatrième jour, changer le milieu tous les deux à trois jours avant d’effectuer l’induction neuronale. Du quatrième au 11e jour, favoriser la prolifération des rosettes neurales dérivées du HESC en ajoutant l’EGF et le bFGF à 10 nanogrammes par millilitre au milieu B27 complété par un cocktail dual-SMAD.
Du jour 11 au 13, la culture des sphères dans le milieu B27 complété par 0,5 inhibiteur micromolaire BMP. Du jour 13 au 21, la culture des sphères en milieu B27 complétée par GDNF et BDNF à 10 nanogrammes par millilitre et un inhibiteur micromolaire gamma-sécréase. Le jour 21, placez un insert de plaque de culture dans un puits d’une nouvelle plaque de six puits.
Par la suite, ajouter un millilitre de milieu B27 complété par des facteurs de croissance et des inhibiteurs à chaque puits sous l’insert membrane. Par la suite, plaquez les sphères sur une membrane ptfe hydrophilique déposée sur un insert de plaque de culture et changez le milieu tous les deux à trois jours pendant les trois semaines suivantes de différenciation. Arrêtez la rotation à partir de cette étape.
La présence de rosettes indique l’initiation de la différenciation neuronale. Du jour 21 au 25, cultiver des organoïdes neuronaux humains dans le même milieu de maturation neuronale. Ensuite, du jour 25 au 28, ne compléter le milieu B27 qu’avec un inhibiteur micromolaire de gamma-sécréase.
Du jour 28 au 39, arrêtez d’ajouter l’inhibiteur de gamma-sécréase et continuez la culture organoïde neurale humaine dans le milieu B27 seulement. Après trois semaines, les organoïdes neuronaux sont prêts à être utilisés pour l’implantation du CPG. Le jour zéro, amplifiez les HESC dans la culture deuxD jusqu’à 60% de confluence.
Ensuite, remplacez le milieu de cellules souches utilisé pour maintenir les caractéristiques de pluripotence des HESC par un milieu sans sérum contenant un cocktail d’inhibition dual-SMAD pour commencer l’induction neurale et inhibiteur rock de 10 micromolaires pour augmenter le taux de survie des cellules pendant le passage le lendemain. Le premier jour, préparer la plaque de microwell avec 2,5 millilitres par puits de milieu sans sérum contenant la même concentration d’inhibiteur du ROCK et de molécules d’inhibition dual-SMAD. Pour différencier les cellules vers le modèle ventral du tube neural, ajoutez shh et FGF8 à 100 nanogrammes par millilitre et deux micromolaires lissés agoniste.
Après avoir ajouté le milieu, centrifuger la plaque à 1200 fois g pendant cinq minutes pour enlever les bulles d’air des microwells. Une fois que la plaque de microwell est prête à employer avec le milieu demi-différeciant, enlevez le milieu des hESCs et lavez rapidement avec le calcium et le magnésium sans chlorure PBS. Dissocier les colonies en une suspension à cellule unique en ajoutant 7,5 millilitres de solution enzymatique recombinante dans un flacon T75.
Incuber les cellules pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, puis ajouter 7,5 millilitres de DMEM F12. Par la suite, recueillir la suspension cellulaire et la centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnatant et comptez les cellules dans le même milieu utilisé pour préparer la plaque de microwell.
Ajustez le volume moyen pour obtenir une suspension cellulaire permettant de former des neurosphères contenant 1000 cellules par microwell en préparant 4,7 millions de cellules en 2,5 millilitres de milieu, et en l’ajoutant aux 2,5 millilitres précédents de milieu déjà placés dans la plaque. Afin de distribuer correctement les cellules dans chaque microwell, secouez doucement la plaque et centrifugez-la à 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour générer des sphères.
Le deuxième jour, rincer délicatement les microwells à l’aide d’un milieu et transférer les sphères dans une plaque de six puits traitée par les tissus. Placez les sphères en rotation à 37 degrés Celsius et changez la moitié du milieu avec un milieu frais tous les deux à trois jours. Le troisième jour à 13, pour augmenter l’induction neurale et convertir en progéniteurs neuronaux avec une identité midbrain, compléter le milieu avec trois micromolaireS GSK-3-bêta inhibiteur.
Divisez l’échantillon en deux nouvelles plaques de six puits traitées par les tissus afin de réduire la densité de la sphère et d’éviter l’agrégation des sphères. Le huitième jour, commencer la maturation neuronale en passant à un nouveau milieu avec des facteurs de croissance et de changer le milieu tous les deux à trois jours. Le jour 21, placez un insert de plaque de culture dans un puits d’une nouvelle plaque de six puits et ajoutez 1,2 millilitres de milieu de maturation neuronale utilisé pour la différenciation de la neurosphère sous l’insert membrane.
Ensuite, déposez la membrane PTFE sur un insert de plaque de culture. Enfin, pour générer l’organoïde neural, semer environ 100 neurosphères dans des conditions d’interface air-liquide sur la membrane PTFE. Arrêtez la rotation à partir de cette étape et changez le milieu tous les deux à trois jours jusqu’à ce que le point de différenciation requis soit atteint.
Voici un schéma d’un protocole normalisé pour la génération d’organoïdes neuronaux dopaminergiques. L’analyse d’immunofluorescence des organoïdes neuronaux dopaminergiques montrés dans ces images indique que les cellules immunoréactives de TH coexpriment Nurr1, un marqueur midbrain-spécifique. Ces deux graphiques représentent la cinétique de l’expression génétique TH et Nurr1 évaluée par RT-PCR quantitative.
Voici un exemple de données brutes enregistrées avec la plate-forme MEA. Chaque pointe est affichée par une ligne verticale tandis que la trace restante est le bruit. Et cette image représente une neurosphère déposée sur le MEA.
Ces graphiques montrent la superposition de pointes typiques détectées à partir des données brutes. La courbe en gras noir indique la moyenne des courbes rouges correspondantes. Cette parcelle raster montre les horodateurs associés à chaque pointe détectée.
Les différentes couleurs mettent en valeur les différentes électrodes. Ces protocoles permettent au chercheur de répondre à des questions sur l’interaction des cellules cancéreuses avec l’organoïde neural ainsi que le dépistage direct avec organoïde dopaminergique.
