Notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer le potentiel angiogénique des neutrophiles primaires tumeur-associés in vivo sans avoir besoin d’employer les modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. L’inhibition directe de la phosphoribosyltransferase nicotinamide, bientôt NAMPT, dans les neutrophiles tumeur-associés avec leur transfert adoptif suivant dans les animaux tumeur-roulement permet la manipulation des neutrophiles sans effets secondaires toxiques systémiques. Nous démontrerons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic manipulés après transfert dans les hôtes tumeur-roulements pour l’étude des immunothérapies neutrophile-basées potentielles dans différents modèles de cancer.
Pour mettre en place un modèle allogénique de souris tumorale, rasez la peau de 10 souris femelles alpha interféron alpha et bêta-récepteurs de 1 mois avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec 70% d’éthanol, puis chargez trois fois 10 aux six cellules de mélanome B16F10 par millilitre de PBS dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de 0,4 par 19 millimètres et injectez 100 microlitres de la suspension sous-cutanée sur un flanc arrière dans chaque Animal. Pour le transfert neutrophile-adoptif, diluer les cellules de mélanome B16F10 à une concentration six fois 10 à la sixième par millilitre dans PBS et diluer les neutrophiles traités avec l’inhibiteur du NAMPT FK866 à six fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration de PBS. Ensuite, mélangez les neutrophiles non traités ou traités par inhibiteur avec les cellules du mélanome à un rapport neutrophile-tumeur de 1:10 et injectez sous-cutanément 100 microlitres de cellules dans jusqu’à cinq souris par groupe.
Après les injections, placez jusqu’à cinq souris femelles injectées dans une seule cage et utilisez des étriers pour mesurer la longueur, la largeur et la profondeur de la tumeur chaque jour pendant 14 jours. Au jour 14 après injection, désinfectez la peau de chaque animal injecté avec 70% d’éthanol et utilisez des ciseaux et des forceps pour récolter les tumeurs dans un tube conique de 50 millilitres contenant un milieu complet sur la glace. Pour sectioner les tumeurs pour l’analyse histologique, submergez les tumeurs dans le composé optimal de température de coupe et congelez les échantillons dans l’azote liquide pour le stockage à moins 80 degrés Celsius.
Le jour de la section, décongeler les échantillons à moins 20 degrés Celsius avant d’utiliser un cryotome pour obtenir des sections de cinq micromètres. Après fixation dans la liaison non spécifique, tacher les sections de tissu de tumeur avec les anticorps primaires d’intérêt pendant une heure à 20 degrés Celsius, suivie de trois lavages dans PBS. Après le dernier lavage, tacher les cellules avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorescence approprié dans un colorant nucléaire comme le DAPI pendant une heure à 20 degrés Celsius protégé de la lumière.
À la fin de l’incubation, séchez les glissières pendant 20 minutes à 20 degrés Celsius à l’abri de la lumière avant de monter les échantillons avec un milieu de montage anhydre, puis couvrez chaque toboggan d’un glissement de couverture et laissez le milieu de montage sécher pendant une heure à 37 degrés Celsius avant d’imagerie des tissus par microscopie fluorescence. Pour l’isolement de neutrophile tumeur-associé, placez cinq tumeurs par puits dans les puits individuels d’une plaque stérile de six puits pendant qu’elles sont récoltées et emploient des ciseaux stériles pour hacher les tumeurs en morceaux de deux à trois millimètres. Ensuite, digérer les fragments tumoraux avec un millilitre de collagène dispase d dnase 1 solution pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% avec l’humidité, mélangeant les échantillons avec une seringue de 10 millilitres toutes les 15 minutes.
À la fin de l’incubation, filtrer les cellules à travers des passoires de 100 micromètres dans un tube de 15 millilitres par puits pour enlever les fibres non digérées et ajouter le PBS à un volume final de 15 millilitres. Recueillir les cellules dissociées par centrifugation et lyser les globules rouges avec un millilitre de tampon de lyse par tube. Après le mélange, mélanger le contenu de chaque tube en un seul tube de 15 millilitres, en arrêtant la réaction après deux minutes avec 11 millilitres de milieu complet de quatre degrés Celsius.
Après centrifugation, resuspendez la pastille en un millilitre de PBS et bloquez toute liaison non spécifique avec trois microlitres d’anticorps fc-bloc pendant 15 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, étiquetez les cellules avec des anticorps anti-CD11b et Ly6G et tout autre anticorps d’intérêt, plus DAPI, pour une incubation de 30 minutes sur la glace protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules en 14 millilitres de PBS et résuspendre les granulés à une fois 10 à la septième cellule par millilitre de concentration moyenne complète fraîche sur la glace, triez ensuite les neutrophiles CD11b-positifs, Ly6G, élevés de DAPI négatifs sur un trieur de cellules activé par fluorescence selon les protocoles de tri standard, vérifiant la pureté des neutrophiles isolés sur le cytomètre d’écoulement à la fin du tri.
Pour l’inhibition in vitro de neutrophile tumeur-associée, graine 1.5 fois 10 aux cinquièmes neutrophiles triés dans chacun des deux puits d’une plaque u-fond de 96 puits et ajoutez FK866 à une concentration finale de 100 nanomolar dans le milieu complet dans un puits et un volume égal de milieu complet seul à l’autre puits. Après deux heures dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules deux fois avec PBS et résuspendez les granulés dans PBS à la concentration appropriée pour l’injection suivante. Les neutrophiles traités par inhibiteur du NAMPT ont une capacité significativement réduite de stimuler la formation de branches aortiques par rapport aux cellules non traitées.
En outre, l’injection sous-cutanée des neutrophiles anti-angiogéniques inhibiteur-traités induit une affaiblissement significative de la croissance de tumeur comparée aux souris injectées avec l’alpha non traité d’interféron et le sous-unité de récepteur bêta 1 neutrophiles de KO. L’examen histologique des tumeurs extraites confirme davantage la suppression significative de l’angiogenèse dans les tumeurs isolées des souris traitées avec des neutrophiles tumeur-associés inhibiteur-traités comparés à ceux injectés avec des neutrophiles de KO non traités. Pour évaluer les propriétés des neutrophiles tumeur-associés FK866-traités, pcr quantitatif et tache occidentale peuvent être exécutés pour étudier l’activation des voies intracellulaires impliquées dans la polarisation de neutrophile.
Puisque les neutrophiles sont de courte durée, il est nécessaire d’effectuer toutes les étapes aussi rapidement que possible et de garder les neutrophiles au froid pendant toute la procédure. Cette technique ouvre la voie à l’étude des mécanismes intracellulaires et des facteurs impliqués dans la régulation des propriétés angiogéniques et tumorigenic des neutrophiles tumeur-associés in vivo.
