Borrelia est un genre de bactéries spirochètes qui englobe trois types principaux. Le groupe de la borréliose de Lyme, le groupe de la fièvre récurrente et le groupe moins bien caractérisé chez les reptiles. De nombreuses espèces de Borrelia sont pathogènes.
La culture de bactéries est l’étalon-or pour la détection de l’infection. Cela est vrai tant pour la recherche que pour le travail clinique. La culture de bactéries à partir de fluides corporels et de tissus confirme que les bactéries sont à la fois viables et se reproduisent.
Ce protocole démontre la méthodologie et les recettes nécessaires pour cultiver et préserver avec succès le groupe de spirochètes de la borréliose de Lyme, la fièvre récurrente Borrelia et Borrelia miyamotoi. Des méthodes sont fournies pour la culture d’espèces et de souches précédemment isolées, ainsi que de nouveaux isolats et d’isolats monoclonaux provenant de sources environnementales ou de mammifères. Marie-Line Faucillion, chercheuse postdoctorale, et Ingela Nilsson, technicienne du Bergstrom Lab, Anne Berthold, associée de recherche du Lloyd Lab, et Maryna Golovchenko, associée de recherche du Rudenko Lab, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, procurez-vous les réactifs nécessaires à la préparation d’un litre de milieu Barbara-Stoner-Kelly, ou BSK-II. Commencez par dissoudre le BSA dans un bécher en remuant l’eau. Ensuite, ajoutez tous les produits chimiques secs et laissez-les se dissoudre avant d’ajouter CMRL.
Ajuster le pH du milieu à 7,6. Si nécessaire, utilisez un hydroxyde de sodium molaire. Ensuite, ajoutez du sérum de lapin au milieu à une concentration de six à 10%Si la croissance bactérienne n’est pas forte, ajoutez-en un autre à 2%sérum au milieu.
Ensuite, stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 micron. Congeler le stock de milieu dans des aliquotes de 100 ou 400 millilitres. Pour les souches de fièvre récurrente, ajouter 100 millilitres de gélatine stérile à 7% à 400 millilitres de milieu BSK-II.
Désinfectez la surface et tous les matériaux avec de l’éthanol à 7% et transférez-les immédiatement dans l’enceinte de sécurité biologique. Les UV stérilisent tous les matériaux non biologiques pendant cinq minutes avant le début des travaux. Pour démarrer une culture, préchauffez le milieu dans un incubateur.
Ajoutez ensuite un millilitre de culture Borrelia décongelée à partir d’un stock de glycérol à cinq à 15 millilitres de milieu BSK préchauffé. Remplissez les tubes presque complètement pour créer une atmosphère micro ou anaérobie avant de les fermer. Cultiver des espèces de fièvre récurrente à 37 degrés Celsius et des espèces de Borrelia burgdorferi sensu lato à 33 à 34 degrés Celsius.
Surveillez la croissance de la culture Borrelia à l’aide de la microscopie à contraste de phase ou à fond noir à un grossissement de 200 à 400 fois. Pour assurer la répartition uniforme des cellules, mélanger la culture avec une pipette sérologique ou utiliser une pipette de transfert de trois millilitres tout en pipetant de haut en bas. Ensuite, chargez à 10 microlitres de culture aliquote de chaque côté d’un hémocytomètre pour le comptage.
Ensuite, diluez la culture de Borrelia en phase exponentielle dans un rapport de un à deux ou d’un à quatre avec un milieu dans un tube de 1,7 millilitre. Lors de la détermination du nombre de cellules, considérez le facteur de dilution de manière appropriée. Après utilisation, vaporiser les surfaces et l’hémocytomètre avec de l’eau de Javel diluée à 10 % et/ou de l’éthanol à 70 %.
Pour l’extraction de l’ADN ou l’isolement des cellules de Borrelia, centrifuger la culture en phase exponentielle pendant 10 minutes à 4 000 g et jeter le surnageant dans un déchet présentant un risque biologique approprié. Traiter les bactéries granulées avec un kit d’extraction d’ADN commercial ou les remettre en suspension dans un milieu approprié pour l’expérience prévue. À la fin de chaque expérience, stérilisez tout l’équipement avec de l’éthanol et des rayons UV.
Collectez les déchets liquides, y compris l’excès de culture, dans une bouteille à déchets et ajoutez 10% d’eau de Javel. Placez la bouteille à 80 degrés Celsius avant de la jeter. Pour le stockage à long terme des cultures Borrelia, prendre le volume souhaité d’une culture en phase exponentielle à 10 millions à 100 millions de cellules par millilitre, ajouter 10% de glycérol stérile et mélanger en pipetant de haut en bas.
Transférer des aliquotes de 1,5 millilitre du mélange dans des flacons cryogéniques à bouchon à vis de deux millilitres. Conservez les flacons de stock à 80 degrés Celsius. Gardez un stock avec au moins 10 tubes de chaque souche dans le congélateur, Pour cultiver Borrelia à partir de tiques dures, collectez des femelles adultes, des mâles et des tiques nymphales.
Stérilisez les tiques en surface en les trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant deux minutes et séchez-les à l’air dans une enceinte de biosécurité. Ensuite, disséquez les tiques individuellement en plusieurs morceaux à l’aide d’un scalpel stérile. Ensuite, placez les morceaux dans un tube de deux millilitres contenant 1,5 millilitre du milieu complété par des antibiotiques.
Incuber les cultures à 34 degrés Celsius et vérifier la présence de spirochètes par microscopie à fond foncé ou à contraste de phase deux fois par semaine pendant les deux premières semaines et chaque semaine par la suite pendant six semaines. Pour cultiver Borrelia à partir d’échantillons de sang, retirez doucement le plasma du tube et inoculez un millilitre de plasma dans cinq millilitres de milieu Kelly-Pettenkofer ou MKP Complete préchauffé, modifié. Pour la culture de Borrelia à partir d’une biopsie cutanée, stériliser en surface la biopsie cutanée avec de l’éthanol à 70% et du peroxyde d’hydrogène.
Ensuite, placez l’échantillon de biopsie dans une solution saline physiologique. Couper l’échantillon en deux à six petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir stérile dans une boîte de Petri en verre tout en étant immergé dans la solution saline physiologique. Transférer l’échantillon coupé en dés et un millilitre de solution saline dans laquelle la biopsie cutanée a été stockée dans cinq millilitres de milieu préchauffé complété par des antibiotiques, et incuber à 33 degrés Celsius.
Pour la fabrication des plaques, chauffer 300 millilitres de milieu complet BSK ou MKP 1,5x sans gélatine. Également chaud 200 millilitres de 1,7% agarose à 55 degrés Celsius. Mélanger les liquides et pipeter 15 millilitres chacun sur 16 boîtes de Petri profondes pour faire la couche inférieure de gélose.
Maintenir le reste du milieu dans un bain-marie. Quantifier la densité de culture de Borrelia et diluer à la densité désirée dans un milieu liquide. Une fois que les plaques inférieures se sont solidifiées, ajouter 10 millilitres du mélange de gélose restant sous forme de gélose supérieure dans un tube de 15 millilitres contenant le nombre approprié de spirochètes.
Versez la suspension sur la plaque de gélose inférieure dans la boîte de Petri étiquetée. Une fois les plaques solidifiées, fermez-les et placez-les à l’envers à 34 à 35 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 2,5%. Lorsqu’il était préparé correctement, le milieu BSK apparaissait rouge-orange et clair.
À titre de comparaison, le milieu non inoculé MKP est également indiqué ici. La prolifération par des bactéries concurrentes génère de la turbidité et des matériaux agglomérés dans le milieu. La croissance bactérienne a été surveillée par inspection visuelle par contraste de phase ou microscopie à fond noir.
Dans la phase exponentielle, les cellules de Borrelia sont généralement minces, pliées et modales dans une certaine mesure. Au fur et à mesure que les cultures entrent dans la phase stationnaire, les corps ronds sont de plus en plus évidents. Les cellules de Borrelia sont fastidieuses et chaque espèce, souche et même isolat diffère à la fois génétiquement et par adaptation à l’hôte à partir duquel elles ont été isolées.
Lors de la fabrication de médias, des ingrédients appropriés font une énorme différence dans la vigueur de la culture Borrelia ou même la viabilité de la culture. Les spirochètes de Borrelia sont difficiles à cultiver, mais la culture est possible. La culture en laboratoire est le tremplin de la recherche sur la biologie de ces bactéries.
La culture fournit le matériel nécessaire pour comprendre le génome, le protéome, l’évolution et les interactions entre les pathogènes de l’hôte de l’espèce Borrelia. La culture de Borrelia peut prendre plusieurs semaines avant que les spirochètes soient suffisamment abondants pour être détectés. Cela limite les applications de diagnostic.
Mais la culture peut montrer si les espèces de Borrelia sont présentes, viables et se reproduisent, et elle peut aider à accéder aux traitements.
