Cette méthode permet de modéliser avec précision les mutations leucémogènes récurrentes du gain de fonction dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines primaires et d’étudier ainsi le rôle dans la transformation leucémique. Le principal avantage de cette technique est que l’ingénierie de mutation basée sur CRISPR-Cas9 est combinée avec l’introduction d’un rapporteur fluorescent. Cela permet de manière unique l’identification, l’enrichissement et le suivi de populations cellulaires hétérozygotes pures.
Tommaso Sconocchia, un chercheur postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, concevez l’ARN guide unique à l’aide de l’outil de conception en ligne Benchling en sélectionnant l’option de création plus. Ensuite, cliquez sur Séquence d’ADN « suivie de l’importation de séquences d’ADN"et importer à partir de bases de données"option.
Ensuite, entrez le gène désiré et sélectionnez l’homme comme espèce. Cliquez sur l’option de recherche et sélectionnez l’importation de transcription correcte. Sélectionnez la région d’intérêt dans laquelle introduire la rupture double brin.
Sélectionnez ensuite l’option CRISPR sur le côté droit de l’écran, suivie des guides de conception et d’analyse. Ensuite, sélectionnez un seul repère tout en conservant la longueur du guide à 20 paires de bases et la séquence PAM pour l’édition avec SP-Cas9. Choisissez un guide avec un score élevé sur la cible et un score hors cible élevé et commandez l’ARN guide unique en tant qu’ARN guide synthétique modifié chimiquement auprès d’un fournisseur commercial.
Pour concevoir le modèle HDR, importez la séquence génomique et la séquence codante dans un logiciel de clonage moléculaire. À partir du fichier de séquence génomique, concevez le bras d’homologie gauche en sélectionnant, idéalement, 400 paires de bases à l’extrémité principale des ruptures double brin et collez cette séquence dans un nouveau fichier. À partir du fichier de séquence génomique, concevez la séquence acceptrice d’épissage en sélectionnant les 150 dernières paires de bases de l’intron ciblé et en la collant après le bras d’homologie gauche.
Dans le fichier de séquence de codage, sélectionnez l’ADNc qui vous intéresse. Codon optimise l’ADNc et l’insère après la séquence accepteur d’épissures. Après l’ADNc d’intérêt, insérer un signal de polyadénylation à trois nombres premiers suivant une séquence promotrice pour la protéine fluorescente.
Ensuite, insérez la séquence pour la protéine fluorescente et un deuxième signal de polyadénylation, mais différent. À partir du fichier de séquence génomique, concevoir le bras d’homologie droit en sélectionnant idéalement 400 paires de bases à l’extrémité principale des ruptures double brin et insérer la séquence après la deuxième polyadénylation. Ensuite, créez une copie de l’ensemble du modèle et modifiez l’ADNc d’intérêt afin qu’il contienne la séquence de la mutation souhaitée.
Échangez la protéine fluorescente avec une protéine fluorescente différente. Construisez et clonez les modèles HDR dans le vecteur d’expression AAV. Pour la préparation recombinante AAV6, préparer 10 boîtes de 150 millimètres contenant chacune 11 millions de HECK293T dans 20 millilitres de DMEM complétées par 10% FBS, 1% de pénicilline streptomycine et 25 millimolaires HEPES.
Ensuite, placez les plats dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, pendant 24 heures. Après avoir soigneusement jeté l’ancien milieu, remplacez-le par 20 millilitres de DMEM sans antibiotique complété par 10% FBS, 25 HEPES millimolaires et un butyrate de sodium millimolaire. Ensuite, préparez deux tubes de 15 millilitres étiquetés tubes un et deux.
Pour le tube un, ajoutez cinq millilitres de milieu sérique réduit, 60 microgrammes de plasmide HDR recombinant avec mutation AAV6 et 220 microgrammes de plasmide auxiliaire PDGM6. Pour le tube deux, ajouter cinq millilitres de milieu sérique réduit et 1120 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution de polyéthylène amine. Après avoir ajouté le contenu du tube deux au tube un, vortex pendant 30 secondes, puis incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
Ajouter délicatement 1,1 millilitre de solution à chaque plat et répartir en remuant doucement. Placez les plats dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, pendant 48 heures. Ajoutez ensuite 250 microlitres d’EDTA 0,5 molaire à chaque plat et placez-les dans l’incubateur pendant 10 minutes.
Récoltez les cellules en les lavant de la capsule et transférez-les dans un tube centrifuge de 500 millilitres. Centrifuger à 2000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Desserrez la pastille par vortex et extrayez le virus à l’aide d’un kit de purification AAV.
Après avoir aliquote le virus purifié, conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Après avoir décongelé les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques CD34 positives, transférer les cellules dans 10 millilitres de RPMI préchauffé supplémenté en streptomycine à 1% de pénicilline. Centrifuger à 350 G à température ambiante pendant 10 minutes.
Suspendre les cellules dans le milieu de rétention des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices à une concentration de 250 000 cellules par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Ensuite, récoltez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Comptez et vérifiez la viabilité de la cellule par exclusion du bleu trypan.
Pour préparer le complexe ribocucléoprotéique, ajoutez 15 microgrammes de Cas9 et huit microgrammes d’ARN guide unique dans un tube de 1,5 millilitre et incuber à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bloc chauffant. Pendant que le complexe ribonucléoprotéique est en incubation, centrifuger les cellules à 350 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant. Après avoir suspendu les cellules dans 100 microlitres de solution de nucléofection, mélanger les cellules avec le complexe ribonucléoprotéique et les transférer dans la cuvette.
Après avoir tapoté doucement la cuvette pour éliminer les bulles d’air résiduelles, insérez la cuvette dans le support du système de transfection et électroporez les cellules. Immédiatement après l’électroporation, ajouter 400 microlitres de milieu de rétention cellulaire de la souche hématopoïétique préchauffée et des progéniteurs sans streptomycine pénicilline et transférer les cellules avec une fine pipette de transfert dans une plaque de culture contenant une souche hématopoïétique préchauffée et un milieu de rétention de cellules progénitrices sans streptomycine pénicilline. Transférez ensuite la plaque dans l’incubateur.
Décongeler les flacons contenant les AAV recombinants congelés sur de la glace et transduire les cellules en pipetant la quantité optimale de chaque AAV6 recombinant sur la suspension cellulaire. Après avoir mélangé doucement la suspension cellulaire avec la pipette, incuber les cellules transduites pendant six à huit heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après six à huit heures, recueillir les cellules dans un tube et les centrifuger à 350 G à température ambiante pendant cinq minutes.
Jeter le surnageant et le remplacer par une souche hématopoïétique fraîchement préchauffée et un milieu de rétention de cellules progénitrices supplémenté en streptomycine pénicilline et transférer les cellules dans une plaque de culture cellulaire. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour trier en flux les cellules modifiées portant la mutation hétérozygote de gain de fonction, récolter les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à 350 G à température ambiante pendant cinq minutes, comme démontré précédemment.
Retirer le surnageant et suspendre les cellules dans un millilitre de DPBS contenant 0,1% de PSA et centrifuger à nouveau à 350 G à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, suspendre les cellules dans un volume approprié de DPBS plus 0,1% BSA en fonction du nombre de cellules, comme démontré précédemment. Transférer les cellules dans un tube de télécopieur stérile muni d’un capuchon et ajouter sept DAA ou un autre colorant de viabilité à la suspension cellulaire pour l’exclusion des cellules vivantes / mortes.
Trier les cellules vivantes qui sont doublement positives pour les protéines rapporteures fluorescentes dans un tube de collecte contenant 200 microlitres de milieu de rétention de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices. Après avoir centrifugé les cellules triées à 350 g à température ambiante pendant cinq minutes comme démontré précédemment, à une concentration de 250 000 cellules par millilitre pour une expansion ultérieure en culture ou utiliser les cellules directement pour des essais fonctionnels. Deux jours après la transvection avec le complexe ribonucléoprotéique et la transduction avec les virus AAV6 recombinants, les cellules ont été analysées par cytométrie de flux.
Quatre populations principales ont été détectées, y compris des cellules sans édition du génome basée sur HDR n’exprimant ni la GFP ni les cellules BFP positives uniquement pour la GFP avec seulement la construction de type sauvage intégrée, les cellules positives uniquement pour BFP avec seulement la construction mutée intégrée, et les cellules GFP et BFP doubles positives avec le type sauvage et les séquences mutées intégrées. Pour valider le knock-in réussi des mutations hétérozygotes de la calréticuline dans/hors PCR, la PCR a été réalisée sur de l’ADN génomique extrait de cellules incubées avec AAV uniquement et de cellules incubées avec la ribonucléoprotéine et l’AAV avec la calréticuline de type sauvage knocked-in et la séquence de délétion de la calréticuline. Les cellules ont été triées en fonction de l’expression simultanée des deux rapporteurs de fluorescence avant l’extraction de l’ADN.
Après l’électrophorèse sur gel, des bandes individuelles ont été excisées du gel et de l’ADN a été extrait pour le séquençage ultérieur de Sanger. Les résultats du séquençage ont confirmé l’intégration transparente réussie du type sauvage et des séquences mutées dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques hétérozygotes mutées à la calréticule. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de sélectionner soigneusement l’ARN guide unique le plus performant, car cela déterminera l’efficacité globale du HDR et, par conséquent, la fréquence de frappe réussie des mutations hétérozygotes.
Après cette procédure, les cellules génétiquement modifiées peuvent être utilisées pour des expériences fonctionnelles in vitro et in vivo telles que des tests unitaires formant des colonies, des tests de différenciation et la transplantation chez des souris immunodéficientes.
