Ce travail est soutenu par le NIH R01 GM47607, CA163296 et NSF 1.334.493 de CET. Nous remercions les membres du laboratoire Turner pour une lecture critique du manuscrit. Toutes les données présentées dans ce rapport ont été reproduits avec l&#39;autorisation de Wormer et al. 2014 11.

1. Préparation de durotaxis Chambers <ol><li> Pour préparer un 6 puits plaque de culture de tissu, tarer la balance avec un tube conique de 50 ml. Peser environ 10 g de la solution de base PDMS dans le tube de 50 ml (la solution est tout à fait visqueux). </li><li> Pour un 90: 1 substrat (conformité de ~ 1 kPa), diviser le poids mesuré de la solution de base PDMS dans le tube par 90 pour déterminer le montant exact de la solution de réticulation nécessaire. Ajouter la quantité calculée d&#39;agent de réticulation de la solution de PDMS dans le même tube. Exemple: 10 g / 90 = 0,11 g. Ajouter 0,11 g de la solution d&#39;agent de reticulation PDMS à la solution de base PDMS. REMARQUE: Les solutions de la base et réticulation sont tous deux fournis dans le kit PDMS. </li><li> Mélanger vigoureusement le mélange base / agent de réticulation PDMS pendant 5 min à température ambiante à l&#39;aide d&#39;une petite spatule. A ce stade, le mélange contiendra un grand nombre de bulles d&#39;air. </li><li> Centrifuger le substrat PDMS dans une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 50 g à RT pour enlever le Bubbles. Si il ya des bulles encore après la 5 min, centrifuger à nouveau. </li><li> Introduire à la pipette 1 ml de 90: 1 PDMS substrat dans chaque puits de la culture de tissus traités plaque à 6 puits. Les bulles d&#39;air restant présent dans les PDMS peuvent être éliminés à ce stade par les éclater en utilisant une aiguille 21 G. Autoriser les PDMS à se répandre pendant 30 min dans le puits. </li><li> Faire bouillir 12 mm verre # 1 lamelles dans de l&#39;eau distillée pendant 5 min. Répétez deux fois et stocker les lamelles dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Placez une, lamelle séchée dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire en touchant doucement d&#39;un côté de la lamelle dans la solution PDMS puis déposez la lamelle sur le PDMS. Comme la lamelle retombée, les PDMS vont commencer à empiéter sur les bords de la lamelle, mais ne couvrira pas complètement. Cela va générer une interface entre les PDMS et verre après le durcissement (voir Figure 1A, B). </li><li> Incuber la plaque à 70 ° C dans un four pendant 16 heures pour guérir (durcir) les PDMS. Placer le plate dans une hotte de culture cellulaire et stériliser UV pendant 10 min. NOTE: Il est préférable de faire les plaques dans quelques jours d&#39;utilisation. Cependant, les plaques peuvent être enveloppés dans du Parafilm sans tampon et conservés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 2 semaines sans diminution notable de la qualité. </li></ol> 2. Cellule Placage NOTE: Si l&#39;étude de l&#39;effet de knockdown de siRNA médiation, effectuer l&#39;effet de choc en utilisant les instructions du fabricant ou le protocole optimisé pour le type de choix de cellule. <ol><li> Enrober chaque durotaxis chambre avec 1 ml de 10 pg / ml de fibronectine dans du PBS sans calcium et de magnésium pendant 1 heure à 37 ° C. En variante, la fibronectine peut être appliqué le jour avant l&#39;analyse par incubation des PDMS avec 10 ug / ml de fibronectine dans du PBS pendant 16 heures à 4 ° C. Assurez-vous que toute la surface est immergée dans la fibronectine dans une solution de PBS. </li><li> Préparer 1% de BSA dénaturée à la chaleur. Peser 0,5 g de BSA et le dissoudre dans 50 ml de PBS.Filtre stériliser la solution à travers un filtre de 0,22 pm et de la chaleur à 80 ° C pendant 12 min. Note: Préparer cette solution la veille à la cellule de placage et conserver à 4 ° C. </li><li> Aspirer la solution de fibronectine et laver 3 fois avec PBS. Ajouter 1 ml de BSA dénaturée par la chaleur dans du PBS à chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Trypsiniser et compter les cellules de choix, tandis que les chambres de durotaxis bloquent avec le BSA dénaturée par la chaleur. </li><li> Plate 1 x 10 5 cellules dans un volume de 2 ml dans chaque puits de la chambre de durotaxis, en utilisant le support requis pour le type particulier de cellule de choix. Permettre aux cellules d&#39;adhérer et se répandent sur ​​le substrat pendant 4 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO 2. REMARQUE: U2OS cellules sont couramment maintenues dans du DMEM avec 10% de FBS, supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, et 10 UI / ml de pénicilline, 10 ug / ml de streptomycine. NOTE: Le nombre de cellules utilisé dans cet exemple est optimisée pourU2OS cellules. Optimisation pour d&#39;autres types de cellules peut être nécessaire. Cette densité donne les cellules assez de place pour migrer sans interactions importantes avec d&#39;autres cellules. </li></ol> 3. imagerie des cellules vivantes <ol><li> Effectuer imagerie des cellules vivantes sur un microscope inversé, en utilisant contraste de phase avec un objectif 10X. Le microscope doit être équipé d&#39;une chambre humidifiée environnement clos, permettant le contrôle de la température à 37 ° C et 5% de CO 2 lors de l&#39;imagerie à long terme. </li><li> Après que les cellules se sont propagées pendant environ 3,5 heures, assembler la plaque dans la chambre de microscope. Laisser l&#39;échantillon (s) à équilibrer dans la chambre pendant 30 minutes. </li><li> Mettre en place automatisée, multi-point en visite sur le microscope si disponible. Concentrez-vous sur l&#39;interface entre les 90: 1 PDMS et la lamelle de verre et choisir les points à l&#39;image tout autour de l&#39;interface avec une moyenne de 40 points par durotaxis chambre. Image les cellules toutes les 10 minutes jusqu&#39;à 16 h. NOTE: La rerégion d&#39;intérêt apparaît sous la forme de deux lignes, avec la ligne extérieure correspondant au bord de la lamelle couvre-objet et la ligne interne correspondant à l&#39;interface réelle entre les PDMS et la lamelle. Voir Figure 1B. </li></ol> Analyse des données 4. <ol><li> Générer un tableur comme dans le tableau 1. </li><li> Comptez le nombre d&#39;événements de passage des PDMS à la surface du verre et vice versa à partir de chaque film généré. Notez le nombre d&#39;événements de passage dans la colonne appropriée dans la feuille de calcul Excel. REMARQUE: Un événement de passage est défini comme le noyau de la cellule en passant au-dessus de la limite entre les PDMS et le verre dans les deux sens. </li><li> Pour quantifier plusieurs passages, compter le nombre de fois que la cellule a traversé l&#39;interface. Ce nombre devrait être enregistrée dans la colonne Excel correspondant au substrat sur lequel la cellule se trouvait à la fin du film. Répétez l&#39;analyse pour chaque cellule qui traverse l&#39;interface en tfilm il. Exclure les cellules qui migrent hors du champ de vision au cours de l&#39;imagerie. NOTE: Il est également important de vérifier, par comptage au début de l&#39;expérience cellule, que les cellules sont capables d&#39;adhérer de manière égale aux PDMS revêtues de fibronectine et les surfaces de lamelle de verre. </li><li> Calculer le pourcentage de cellules qui ont migré à partir de PDMS à la surface du verre (par exemple, a subi durotaxis). Ajouter le nombre de traverser les événements de doux à dur et les multiples événements de passage qui se sont terminées sur le disque et diviser par le nombre total d&#39;événements de passage. </li><li> Calculer le pourcentage de multiples passages en divisant le nombre de multiples passages par le nombre total de passages. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing.">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li><li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis.">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).</li><li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness.">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li><li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

Ici, nous décrivons un test simple pour étudier durotaxis dans les cellules de la migration. Une des grandes forces de ce test est la facilité de préparation des chambres de durotaxis utilisant PDMS. La rigidité des substrats peut être facilement manipulé en changeant le rapport de la solution de base PDMS agent de reticulation afin de permettre l&#39;étude des diverses rigidités dans le dosage. Cependant, une limitation potentielle du système est que les cellules ne sont exposés à un seul changement de rigi...

La matrice extracellulaire (ECM) est constitué d&#39;un ensemble complexe de protéines de structure de réticulation et y compris le collagène, la fibronectine et la laminine. Bien qu&#39;il soit bien établi que l&#39;ECM fournit un soutien structurel important pour les tissus cellulaires, il est de plus en plus de preuves pour indiquer que les cellules réagissent activement aux changements physiques de leur environnement ECM pour réguler divers processus cellulaires, y compris la survie cellulaire, la différenciation et la migration cellulaire. Par exemple, les différences dans la rigidité de l&#39;ECM peuvent conduire les cellules souches mésenchymateuses vers différentes lignées, avec des substrats souples (~ 1 kPa) promotion lignées neurogéniques tout raides (~ 25 kPa) substrats favorisent la différenciation ostéogénique 1. De même, a montré une augmentation de la rigidité de la matrice du stroma, de promouvoir la tumorigenèse mammaire de cellules épithéliales et dans l&#39;invasion des tissus environnants 2,3. Un aspect particulièrement intéressant de la présente mechanosignrésultats de l&#39;activité de aling dans un processus connu sous le nom durotaxis, dans lequel les cellules migrent préférentiellement vers un substrat plus rigide. 4,5 Les cellules détectent en permanence les caractéristiques physiques de leur environnement extracellulaire par récepteur d&#39;intégrine de liaison à l&#39;ECM. Ceci, à son tour, favorise l&#39;accumulation de nombreuses protéines de structure et de signalisation de leurs domaines cytoplasmiques pour entraîner la formation de structures adhésives connues sous le nom adhésions focales focales ou des contacts 6,7. Depuis intégrines ont pas d&#39;activité enzymatique inhérente, les signaux sont relayés de l&#39;ECM à travers ces protéines accessoires pour coordonner la réponse de la cellule à leur environnement changeant 8. En conséquence, l&#39;identification et la caractérisation des protéines clés impliquées dans la régulation mechanosignaling et durotaxis est un domaine de recherche important. Différents systèmes de modèles ont été mis au point pour étudier durotaxis in vitro, mais la plupart ontutilisés substrats de Polyacrylamide enrobé de collagène 4. Cependant, la préparation des substrats de Polyacrylamide peut être techniquement difficile et le collagène utilisé dans ces essais doit être chimiquement réticulé sur le substrat neuf. Polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats se sont révélés présenter des propriétés mécaniques comparables aux substrats de Polyacrylamide à 10. Toutefois, les substrats PDMS sont préparées en mélangeant simplement un rapport de la base pour agent de réticulation et de ces substrats peuvent être revêtus avec des protéines d&#39;ECM sans la nécessité d&#39;une reticulation chimique, ce qui rend PDMS un outil plus facile à étudier les effets de la rigidité sur le comportement de la cellule. Ici, nous décrivons comment préparer une chambre de durotaxis simple dans lequel un substrat de PDMS souple est intégré avec une lamelle de verre rigide. L&#39;essai, comme indiqué ci-dessous, fournit une méthode simple et rapide pour étudier durotaxis. Pour cette étude, nous avons utilisé des cellules d&#39;ostéosarcome de U2OS humaines combinées avec le siRNA médiationknockdown de cdGAP pour étudier le rôle de cette protéine d&#39;adhésion focale dans durotaxis 11. Surtout, ce protocole peut être facilement adapté aux besoins individuels. Autres types de cellules peuvent être substitués pour les cellules U2OS et toute protéine peuvent être renversés ou surexprimés pour déterminer les effets sur le comportement des cellules pendant durotaxis. En outre, ce protocole peut être adapté pour incorporer des protéines par fluorescence marqués d&#39;analyser leur dynamique et leur comportement à l&#39;aide FRAP ou FRET approches.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Cover glass 12mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

Les propriétés mécaniques et la composition de la matrice extracellulaire sont très variables entre les différents types de tissus. Cette diversité de stroma de tissu conjonctif considérablement le comportement des cellules des impacts pour réguler les processus normaux et pathologiques, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la signalisation de l&#39;adhésion et la migration directionnelle. À cet égard, la capacité innée de certains types de cellules de migrer vers un substrat rigide, ou moins conforme matrice est appelée durotaxis. Ce phénomène joue un rôle important au cours du développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et l&#39;invasion des cellules cancéreuses. Ici, nous décrivons un test simple à étudier durotaxis, in vitro, utilisant polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats. Préparation de la durotaxis décrit chambres crée une interface entre la rigidité du gel de PDMS relativement mou et une lamelle de verre rigide. Dans l&#39;exemple fourni, nous avons utilisé ces durotaxis chambres de démontrer un rôle pour le cdc42 / Rac1 activation GTPase protedans, cdGAP, dans les mécanorécepteurs et durotaxis la réglementation dans les cellules d&#39;ostéosarcome humain U2OS. Ce test est facilement adaptable à d&#39;autres types et / ou knockdown d&#39;autres protéines cellulaires d&#39;intérêt à explorer leurs rôles respectifs dans mechanosignaling et durotaxis.

Un schéma de la chambre de durotaxis est représentée sur la Figure 1A. Substrat de PDMS souple (un 90 mélange 1 de la base PDMS agent de reticulation solutions) est réparti dans une boîte de 6 puits et une lamelle de verre est placée sur le dessus du PDMS, qui couvre alors partiellement la surface supérieure de la lamelle couvre-objet, en créant ainsi une interface entre les deux substrats différents de conformité. La rigidité du substrat de PDMS est doux ~ 1 kPa, ce qui est comparable à la...

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A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Un système simplifié pour la cellule évaluation mechanosensing et durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.1K vues.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

La transgénèse Zebrafish Mosaic pour évaluer des séquences Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Recherche

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Évaluation des effets phytochimiques sur Helicoverpa armigera au moyen d’un essai d’alimentation

Developing a Feeding Assay System for Evaluating the Insecticidal Effect of Phytochemicals on Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and agricultural productivity. In response, plants produce several phytochemicals that negatively impact the insect's growth and survival. This protocol demonstrates an obligate feeding assay method to evaluate the effect of a phytochemical (quercetin) on insect growth, development, and survival. Under controlled conditions, the neonates were maintained until the second instar on a pre-defined artificial diet. These second-instar larvae were allowed to feed on a control and quercetin-containing artificial diet for 10 days. The insects' body weight, developmental stage, frass weight, and mortality were recorded on alternate days. The change in body weight, the difference in feeding pattern, and developmental phenotypes were evaluated throughout the assay time. The described obligatory feeding assay simulates a natural mode of ingestion and can be scaled up to a large number of insects. It permits one to analyze phytochemicals' effect on the growth dynamics, developmental transition, and overall fitness of H. armigera. Furthermore, this setup can also be utilized to evaluate alterations in nutritional parameters and digestive physiology processes. This article provides a detailed methodology for feeding assay systems, which may have applications in toxicological studies, insecticidal molecule screening, and understanding chemical effects in plant-insect interactions.

Pleins feux sur l’auteur : Développement et défis des tests d’alimentation pour la lutte contre les insectes nuisibles 

This protocol describes the obligate feeding assay to evaluate the potentially toxic effect of a phytochemical on the lepidopteran insect larvae. This is a highly scalable insect bioassay, easy to optimize the sublethal and lethal dose, deterrent activity, and physiological effect. This could be used for screening eco-friendly insecticides.

Mise au point d’un système d’analyse de l’alimentation pour évaluer l’effet insecticide des composés phytochimiques sur Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and ...