Des modèles animaux fiables sont des éléments essentiels de la recherche fondamentale. Notre approche murine permet de répondre à des questions immunologiques sur la mécanistics et la cinétique du développement aigu des lésions pulmonaires chez les mammifères. Une invasivité minimale, une manipulation simple, ainsi qu’une bonne reproductibilité sont les principaux avantages de cette technique.
En outre, avec la titration de dose, nous pouvons moduler l’effet clinique. Cette technique reflète la situation clinique des patients présentant des lésions pulmonaires graves et permet d’étudier les mécanismes sous-jacents. Conservez la lipopolysaccharide, ou LPS, en aliquots à une concentration de cinq milligrammes par millilitre à moins 20 degrés Celsius.
Pour l’instillation intratracheal, diluer le LPS décongelé dans la solution saline tamponnée stérile de phosphate à une concentration finale de 2000 microgrammes par millilitre. Couper un cathéter veineux de calibre 22 sur une longueur de 20 millimètres. Placez la souris en position couchée sur une table à température contrôlée pour maintenir une température corporelle de 37 degrés Celsius.
Après anesthésie telle que décrite dans le protocole textuel, appliquer un lubrifiant ophtalmique stérile pour prévenir la dessiciation des cornées sous anesthésie. Soulevez la tête et crochetez les incisives sur une barre horizontale placée à environ cinq centimètres au-dessus de la table pendant que les scies avant restent en contact étroit avec la table. Super-étendre le cou dans un angle de 90 degrés par rapport à la table.
Placez une source de lumière froide sur la peau au-dessus du larynx pour aider à visualiser les cordes vocales et viser la trachée. Tenez la langue avec des forceps pour redresser la gorge pour des conditions d’intubation plus faciles. Une visualisation et une identification adéquates du larynx sont essentielles pour assurer un placement intratracheal correct du cathéter.
Une source externe de lumière froide aide à cette étape. Insérez le cathéter d’environ 10 millimètres dans la trachée. Assurez-vous que l’insertion n’est pas trop profonde, car cela se traduira par l’instillation unilatérale de liquide dans la bronche principale droite ou gauche.
En cas de résistance au larynx, rétractez le cathéter de quelques millimètres avant d’avancer à nouveau. Maintenant, injectez le MPBS dilué LPS à l’aide d’une pipette. Le volume injecté dépend du poids corporel de la souris.
Connectez une seringue et ajoutez un bolus de 50 microlitres d’air pour vous assurer que le volume liquide complet est distribué dans les poumons. Retirez lentement le cathéter. Gardez le haut du corps de la souris en position verticale pendant 30 secondes pour éviter les fuites du liquide de la trachée.
Fixer la souris euthanasiée avec du ruban adhésif sur une table d’opération et désinfecter rapidement la fourrure sur l’abdomen avec 70% d’éthanol. Ouvrez soigneusement la cavité abdominale dans la ligne médiane avec des ciseaux et des pinces à épiler. Enlever certaines parties de l’intestin pour atteindre l’accès à la véna cava droit inférieur à la colonne vertébrale dans l’aorte abdominale.
Localiser les veines rénales et insérer une canule courbée de calibre 23 reliée à une seringue d’un millilitre dans la veine cava inférieure, directement en dessous de la confluence des veines. Aspirer 250 microlitres de sang et transférer dans un tube de 1,5 millilitre rempli de 20 microlitres de 0,5 molar EDTA solution. Agiter doucement pour faciliter le mélange EDTA et mettre le tube sur la glace.
Pour le lavage bronchoalveolar, préparez trois seringues d’un millilitre, chacune avec 0,5 millilitres de PBS stérile et 0,1 millilitre d’air. Désinfecter la fourrure de la gorge avec 70% d’éthanol et exposer soigneusement la trachée avec des ciseaux et des pinces à épiler. Mobilisez la trachée et enroulez une suture autour d’elle.
Percer la trachée à l’aide de micro-ciseaux et insérer un cathéter veineux de calibre 22, coupé à une longueur de 20 millimètres. Fixer le cathéter avec une suture et instiller 0,5 millilitres de PBS stérile et 0,1 millilitre d’air. Aspirer le liquide après 60 secondes.
Répétez la procédure avec les deux seringues supplémentaires et recueillez l’aspirate entier dans un tube de 15 millilitres sur la glace. Ouvrez soigneusement le thorax avec des ciseaux et des pinces à épiler pour récolter les poumons. Couper le diaphragme le long de la marge costale et couper à travers les côtes avec deux incisions latérales.
Évitez soigneusement de percer les poumons. Soulevez le sternum cranially et fixez ou enlevez-le. Préparer deux seringues de 10 millilitres avec du PBS chaud de 37 degrés Celsius.
Faire une petite incision dans le ventricule gauche. Percer le ventricule droit à l’œil d’une canule de calibre 26. Puis, rincer la circulation pulmonaire avec un PBS préchauffé.
Soyez conscient que les poumons pâlissent pendant l’intervention. Retirer le lobe droit des poumons et le couper en deux. Snap les congeler dans l’azote liquide suivie d’un stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius pour une plus grande expression des gènes et l’analyse des protéines.
Enlevez le poumon gauche entier et homogénéisez-le dans une plaque de 48 puits en haillant le tissu avec des ciseaux et des pinces à épiler. Incuber le tissu en deux millilitres de tampon de digestion à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Effectuez une homogénéisation plus complète en pipetting soigneusement les morceaux de tissu pulmonaire de haut en bas.
Transférer les échantillons de sang dans cinq tubes FACS millilitres et mélanger délicatement le sang avec deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Mettez les tubes sur la glace et terminez la réaction après deux minutes en ajoutant deux millilitres de PBS glacé. Centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 400 fois g et jeter le surnatant.
Resuspendez la pastille cellulaire avec 60 microlitres de tampon FACS et le processus pour la coloration ultérieure FACS selon les protocoles précédemment décrits. Centrifugeuse de liquide BAL pendant cinq minutes à 400 fois g. Aspirez le supernatant et congelez-le dans de l’azote liquide, suivi d’un stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus poussée des protéines.
Après avoir résuspendé la pastille de cellules BAL avec deux millilitres de tampon FACS froid, transférer la suspension dans un tube FACS de cinq millilitres à l’aide d’un filtre à mailles de 100 microns pour retenir les poils. Après avoir centrifugé l’échantillon à nouveau, resuspendez la pastille avec 60 microlitres de tampon FACS et le processus pour la coloration ultérieure FACS selon les protocoles précédemment décrits. Maintenant, transférez le tissu pulmonaire gauche digéré dans un tube FACS de cinq millilitres à l’aide d’un filtre à mailles de 100 microns pour extraire les touffes.
Mettre fin au processus de digestion en ajoutant deux millilitres de tampon FACS glacé avant de centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 400 fois g. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille avec 60 microlitres de tampon FACS et le processus pour la coloration ultérieure FACS selon les protocoles précédemment décrits. Pour une analyse FACS, ajouter 20 microlitres de solution de blocage d’anticorps CD16/CD32 à 60 microlitres de cellules dans un tube de cinq millilitres.
Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour bloquer la liaison non spécifique de l’immunoglobuline aux récepteurs fc. Pendant ce temps, préparer un mélange maître avec tampon FACS et anticorps, tel que décrit dans le protocole de texte. Après le blocage, ne lavez pas les cellules.
Ajouter 20 microlitres de mélange maître anticorps par échantillon pour obtenir un volume final de 100 microlitres. Incuber les échantillons pendant 20 minutes, dans l’obscurité, à quatre degrés Celsius. Lavez chaque échantillon avec un millilitre de tampon FACS et centrifugeuse comme avant.
Jetez le supernatant et réutilisez la pastille avec le tampon FACS à la concentration cellulaire appropriée pour les mesures facs. Enfin, ajoutez des nombres fixes de perles d’étalonnage couplées au fluorochrome disponibles dans le commerce à chaque échantillon pour déterminer le nombre absolu de cellules. Effectuez la cytométrie d’écoulement en utilisant la stratégie de gating indiquée dans le protocole de texte pour le sang, le BAL, et les cellules de tissu.
24 aussi bien que 72 heures suivant instillation intratracheal, l’expression de TNF-alpha dans le tissu de poumon a été sensiblement augmentée, atteignant une augmentation soutenue et plus de 50 fois comparée aux animaux de contrôle. L’invasion de leucocytes dans les tissus et l’espace alvéolaire est une caractéristique et une caractéristique pour le développement de lésions pulmonaires aiguës. L’analyse de FACS a indiqué une infiltration significative des granulocytes neutrophiles dans l’interstitium de poumon, avec le nombre absolu de cellules ayant augmenté presque neuf fois comparé aux contrôles après 24 heures.
Le nombre absolu de granulocytes neutrophiles a légèrement diminué après 72 heures, cependant, l’augmentation de facteur comparée aux contrôles est restée. Conformément à l’infiltration interstitielle de granulocyte neutrophile, l’expression de MMP-9 dans le tissu entier de poumon a également été sensiblement augmentée au cours de la période totale d’observation. Les granulocytes neutrophiles ont été non seulement augmentés dans le tissu pulmonaire, mais également dans le fluide de BAL.
L’augmentation de pli par rapport aux animaux de contrôle était plus prononcée que dans le tissu pulmonaire. L’oedème pulmonaire dû à l’affaiblissement grave de la barrière alvéolocapillaire est pathognomonic pour le développement des dommages aigus de poumon. L’analyse du contenu d’albumen dans le fluide de BAL par ELISA a indiqué une perte significative de fonction de barrière à 24 heures et 72 heures après instillation de LPS.
Le placement approprié de cathéter est crucial pour l’instillation bilatérale de LPS. Souvent, les changements dans les modèles respiratoires, tels que la toux ou le haleter, indiquent l’instillation intratrachéale correcte du fluide. Après l’induction de lésions pulmonaires aiguës, un certain nombre d’étapes subséquentes, telles que l’analyse du FACS, la PCR, une détection de protéines, peuvent être effectuées pour répondre aux questions de recherche respectives.
