The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).

NOTE: Toutes les procédures décrites ici ont été examiné et approuvé par l&#39;Université de Louisville Comité institutionnel de biosécurité (protocole N ° 13 à 056) et institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (protocole # 13-064). 1. Préparation du colorant <ol><li> Diluer à 0,1% (p / v) de bleu de Coomassie dans du PBS et stériliser par filtration à l&#39;aide d&#39;un filtre à seringue de 0,45 uM. </li></ol> 2. Préparation de la culture de Pseudomonas aeruginosa <ol><li> 15 heures avant l&#39;instillation, inoculer 3 ml de bouillon de culture avec une seule colonie bactérienne. </li><li> Cultiver la culture 15 heures à 37 ° C sur un agitateur (200 rpm). </li><li> Centrifugeuse 1 ml de culture dans un tube de 1,5 ml à centrifuger 12 000 g pendant 30 sec. </li><li> Retirez le support et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS. </li><li> Diluer une partie aliquote de la suspension de pâte bactérienne 1:10 dans du PBS et mesurer la DO 600 de la suspension bactérienne diluée pour déterminer laconcentration bactérienne. </li><li> Diluer la suspension bactérienne dans du PBS à la concentration souhaitée de l&#39;inoculum bactérien, en utilisant un volume de 50 ul de livraison pour l&#39;inoculation IMIT. </li></ol> 3. IMIT instillation <ol><li> Placer un groupe de souris dans la chambre d&#39;induction d&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane et anesthésier en utilisant un 2 - mélange isoflurane / oxygène de 3%. </li><li> A l&#39;apparition initiale de la sédation, la nuque la souris, la souris maintien en position verticale, et d&#39;administrer 10 ul d&#39;une solution de lidocaïne à 2% en aiguille de gavage à l&#39;arrière de la gorge et permettre à la solution de drainer vers le bas à l&#39;épiglotte. Retour de la souris à la chambre de l&#39;anesthésie. <ol><li> Prévoir un minimum de 5 min pour permettre la lidocaïne à prendre pleinement effet comme un anesthésique local. </li></ol></li><li> Lorsque les souris ont atteint le niveau désiré de sédation (taux de ~ 60 bpm à respirer), réduire l&#39;isoflurane à 2% pour maintenir la sédation. </li><li> colorant de précharge ou inoculum bactérien dans 250 pi étanche aux gazseringue ajustement de précision avec une longue aiguille émoussée 22 G. <ol><li> Première dresser 150 pi de l&#39;air, mesurée par le piston en téflon de la seringue. Ensuite, dessinez en hausse de 50 ul d&#39;inoculum en avançant le piston en téflon de la barre des 150 pi à la marque de 200 pi sur le corps de la seringue. NOTE: Lorsque l&#39;échantillon est éjecté dans une souris intubé, la suspension de 50 pi sera livré en premier, suivi par un pl coussin d&#39;air 150 qui distribuera l&#39;inoculum dans l&#39;ensemble du poumon. </li></ol></li><li> Retirer une souris de la chambre de l&#39;induction et de jeter sur le dos sur une plate-forme d&#39;intubation. Fixer la souris pour la plate-forme en accrochant ses incisives avec un joint torique attaché à bande Velcro, et la fixation du velcro à la plate-forme. Levez la souris pour une pente de 45 °. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un coton micro applicateur, retirer la langue avec un mouvement de roulement, en utilisant la main dominante. </li><li> Avec la main non dominante, utiliser un ajustement otoscope fonctionnant avec un spéculum d&#39;intubation à la fois maintain langue rétraction et de visualiser la glotte. </li><li> Avec la main dominante, utiliser un fil de guidage enfilée à travers un G cathéter 20 à intuber la souris, d&#39;un coin du cathéter jusqu&#39;à une profondeur de 10 mm dans la trachée de souris (cathéter est en forme d&#39;un manchon en silicone avec 10 mm de cathéter exposé). Retirez le otoscope / spéculum. </li><li> Assurez-vous que la souris a été correctement intubé en fixant le cathéter avec la main non dominante tout en attachant une longueur brièvement connecté Luer de 1/16 &quot;tube transparent contenant un colorant. NOTE: Le colorant sera rapidement migrer et venir en réponse à la respiration. </li><li> Ne pas procéder à des étapes ultérieures si la confirmation de l&#39;intubation n&#39;a pas été établie à ce stade. Si l&#39;intubation a tenté a échoué, réinitialiser le fil de cathéter et le guide pour une tentative supplémentaire d&#39;intubation. REMARQUE: Il est déconseillé de tenter plus de deux intubations d&#39;une souris dans une seule session sans causer un traumatisme à la souris. </li><li> Continuer àfixer le cathéter avec la main non dominante tout en insérant la seringue de précision / aiguille émoussée contenant le liquide coussin suspension / air. </li><li> Verser le liquide / air directement dans les poumons dans un seul mouvement fluide et retirer immédiatement l&#39;aiguille / cathéter de la souris. </li><li> Retour de la souris dans une cage et permettre la récupération de l&#39;anesthésie. </li></ol> 4. Caractérisation des IMT livraison <ol><li> Après IMIT instillation, euthanasier la souris en CO 2 asphyxie à un post-inoculation de temps approprié. </li><li> Fixer la souris euthanasiés sur une planche de dissection et faire tremper la poitrine et l&#39;abdomen avec EtOH à 70% en utilisant un vaporisateur. </li><li> Si l&#39;évaluation de la distribution d&#39;un agent de formation d&#39;image à travers le poumon, retirer les poumons de l&#39;animal en utilisant une technique stérile et afficher les poumons comme approprié pour l&#39;imagerie. REMARQUE:. Poumons peuvent être préparés pour les techniques de coloration histologique supplémentaires grâce à la fixation ou la cryoconservation approprié &lt;/ Li&gt; <li> Si l&#39;évaluation de la charge bactérienne du tissu pulmonaire infecté, retirez les poumons de l&#39;animal en utilisant une technique stérile. La place poumons dans un stérile, préalablement pesé 1 sac de prélèvement des oz. Peser et noter le poids de l&#39;échantillon sac + poumons. <ol><li> Ajouter 1 ml de PBS stérile 1x pour chaque échantillon sac + tissus. Refermer le sac de l&#39;échantillon. </li><li> Homogénéiser les tissus par les douces ondulations une pipette de 25 ml sérologique sur l&#39;échantillon + sac tissu. </li><li> Générer des dilutions en série de l&#39;homogénat de poumon dans du PBS stérile et plaque sur plaque de gélose (LB, ou le cas échéant à des espèces bactériennes étudiées): <ol><li> Réaliser une dilution en série six fois en un demi-fond plaque de 96 puits par Pipettes multicanaux puis la plaque échantillons en triple par multicanaux sur la plaque de gélose. </li></ol></li><li> Incuber les plaques de gélose pendant une nuit à 37 ° C et dénombrer les unités formant des colonies le jour suivant. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

IMIT instillation offre des améliorations importantes aux modèles de maladies respiratoires existantes dans la capacité d&#39;inculquer reproductible réactifs directement dans les poumons. Il est une approche rapide qui est idéalement situé pour une équipe de deux chercheurs, l&#39;un des qui gère la logistique de l&#39;anesthésie et de mise en cage, et l&#39;autre qui exécute la technique de la GI-TI. De grandes études peuvent être réalisées à l&#39;aide IMIT avec un engagement de temps moyen de 2 - 3 min par souris. Parce que l&#39;approche fait usage de l&#39;isoflurane comme anesthésique, les souris récupérer rapidement de l&#39;anesthésie, la réduction du temps de garde des animaux de surveillance grâce à la récupération. L&#39;aspect le plus difficile techniquement de la méthode de la GI-TI est la première étape de l&#39;intubation souris. Les personnes qui apprennent à effectuer IMIT sont en mesure de se concentrer sur cette première étape de la pose du cathéter et veiller à ce que l&#39;intubation a été réalisé grâce à la confirmation visuelle de mouvement de colorant. L&#39;avantage de cette approche est que poumon-specIFIC instillation est garantie grâce à l&#39;utilisation de la confirmation de l&#39;intubation, ce qui augmente la confiance à la fois du nouveau chercheur ainsi que l&#39;expert de tenter d&#39;intuber un animal difficile. Les éléments clés de l&#39;optimisation de la probabilité d&#39;une intubation sont: i) la réalisation d&#39;un sédation profonde pour laisser le temps de travail suffisant, ii) le placement correct de la spéculum dans la bouche pour permettre une bonne visualisation de l&#39;épiglotte, iii) le placement de bonne profondeur de la spéculum de sorte que la langue reste en retrait tout au long de la procédure, et iv) l&#39;utilisation de la plate-forme basculante pour soutenir les mains du chercheur ainsi que la procédure se déroule détendu et avec une approche stable. Une des limites de la procédure de IMIT est liée à la fréquence des événements IMIT d&#39;instillation. À cause du traumatisme potentiel associé à une intubation raté, il est déconseillé de plus de deux tentatives d&#39;intubation être effectuées en une seule séance (jusqu&#39;à deux accidents). IMITa un excellent potentiel dans sa capacité à être utilisé pour fournir des traitements dans les poumons de souris, les schémas thérapeutiques mais qui font usage de livraison très fréquent de réactif dans les poumons peuvent ne pas convenir pour la GI-TI. Il est possible que la GI-TI pourrait être utilisé tous les jours pour fournir des réactifs dans un poumon de souris sans causer de traumatisme important, mais que lorsqu&#39;ils sont réalisés par un chercheur hautement qualifié, comme la majorité des traumatismes liés à l&#39;intubation est pensé pour être associé à un événement d&#39;intubation manquer . Cette IMIT haute fréquence doit être discuté avec les vétérinaires locaux et IACUC. Une limitation potentielle supplémentaire de la GI-TI est la taille de la souris qui est intubé. La procédure de IMIT décrit ci-dessus a été développé en utilisant des souris d&#39;environ 17 à 22 g, où un cathéter de 20 G a été trouvé être d&#39;une taille adaptée à la trachée de souris dans cette gamme de tailles. Grandes cathéters ont été utilisés avec succès chez la souris âgées; le développement initial de la GI-TI made utilisation d&#39;un cathéter 18 G dans souris BALB / c qui sont&gt; 20 g. Il est important, si les tailles de cathéters de remplacement sont utilisées, les aiguilles doivent être franches qui proviennent adapter à la lumière du cathéter et sont coupés à une longueur qui étend seulement 1 mm au-delà de l&#39;extrémité du cathéter. Intubation de souris plus petites que 17 g peut être possible mais pas recommandé en raison de l&#39;expertise requise, et nécessitait l&#39;utilisation de cathéters plus petits et spéculums sont que décrit ci-dessus. Nous avons utilisé IMIT pour la livraison de plusieurs agents pathogènes des voies respiratoires, en plus de P. aeruginosa, y compris B. pseudomallei 9 et 10 Klebsiella pneumoniae. Le modèle de la GI-TI a fait d&#39;importants progrès pour nos études de B. maladies respiratoires pseudomallei, après avoir identifié que l&#39;inoculation intranasale entraîne, une morbidité URT-connexe début de souris plutôt que le critère de la maladie systémique observée dans la maladie humaine 9. B. pseudomallei est un Tier 1 Select l&#39;agent de l&#39;impact de la biodéfense, et que ces modèles de maladies respiratoires, sont en cours d&#39;élaboration pour l&#39;exposition aux aérosols qui modèles liés à la biodéfense un itinéraire potentiel d&#39;entrée pour les agents pathogènes en armes. Parce que les modèles courants d&#39;aérosol entraîner une infection à la fois l&#39;URT et TLR, les mêmes potentiels phénotypes de morbidité début nous avons identifié pour le modèle intranasale de B. maladies respiratoires pseudomallei peut demander au modèle d&#39;aérosol. Une adaptation future du modèle de la GI-TI pourrait être une administration par aérosol intubation médiation (IMAD), dans laquelle des souris sont intubé pour livraison cible d&#39;aérosol dans les poumons seulement. Ventilateurs mécaniques sont actuellement disponibles pour maintenir l&#39;anesthésie isoflurane, qui pourrait être adapté pour fournir un, plutôt que sur la base liquide, défi de l&#39;agent pathogène en aérosol. IMIT a été développé initialement comme une approche pour optimiser la distribution des bactéries dans les poumons, mais a aussi une application pour la fourniture d&#39;autres réactifs dans les poumons de souris. Comme disjuré ci-dessus, l&#39;administration intranasale de composés chez des souris se traduit par une faible efficacité, livraison très variable des réactifs dans l&#39;organe cible du poumon. L&#39;administration intranasale de positons tomographie par émission (PET) réactifs d&#39;imagerie dans les poumons de souris a donné une livraison efficacité de 40% 11, alors que nous avons démontré que la GI-TI offre une excellente alternative à d&#39;autres la livraison du poumon approches avec son&gt; 98% d&#39;efficacité de la livraison et de la distribution multilobaire. Cette amélioration de la délivrance ciblée dans le poumon a le potentiel d&#39;augmenter la reproductibilité de la libération de produits thérapeutiques pour le traitement de maladies pulmonaires. IMIT pourrait de même offrir des avantages aux études de: i) l&#39;impact des irritants pulmonaires environnement, ii) cancer du poumon études phénotypiques, iii) siRNA spécifiques poumon knock-down.

Les souris ont été utilisés pour modéliser les nombreuses manifestations pathologiques chez l&#39;homme, comprenant une multitude de maladies respiratoires. Des modèles de maladies de substitution sont souvent incapables de récapituler tous les aspects d&#39;une maladie modélisé, typiquement en raison des différences physiologiques importantes ou immunitaires dans les deux modèles d&#39;accueil. Ainsi, le but d&#39;améliorer les systèmes de modèle est de développer des approches qui permettent à des substituts reflètent plus étroitement un processus de maladie ou réponse de l&#39;hôte comme on l&#39;observe dans le système hôte d&#39;origine. Il existe plusieurs différences physiologiques importantes entre les souris et les humains dans le mécanisme par lequel ils inspirer l&#39;air. Parmi ces différences sont des différences significatives ratiométriques de taille entre l&#39;URT et LRT. Il a été estimé que les souris possèdent&gt; 100 fois la RUT surface par rapport à l&#39;être humain, contre normalisée totale de 1,2 capacité pulmonaire. Ainsi, les cornets nasaux de la souris permettent plus vaste filtrage de l&#39;air inspiré à faciliter une plus grande vitesse de breathing, qui peut avoir un impact significatif sur les études de pneumonie en cas d&#39;infection de la cavité nasale joue un rôle important dans la progression de la maladie. Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris pour étudier les maladies respiratoires de l&#39;homme-comme. La plus courante de ces approches est l&#39;inoculation intranasale, dans lequel une suspension liquide est appliquée à une ou aux deux narines de souris. Bien que relativement simple, mises en garde telles que le volume d&#39;instillation et le type d&#39;anesthésie utilisé peut influer sur le rendement de l&#39;instillation dans la LRT par inoculation intranasale 3-5. Plus précisément, Miller et al. ont montré que l&#39;instillation intranasale de Francisella tularensis des volumes de moins de 50 pi n&#39;a pas abouti à l&#39;instillation des bactéries dans le TLR 6. Ils ont observé en outre mieux instillation de TLR lors de l&#39;utilisation de l&#39;isoflurane inhalé par opposition à injection de kétamine / xylazine pour l&#39;anesthésie. Cependant, notre expérience avec Yersinia pestis inoculation intranasale indique inoculation plus cohérente peut être réalisé en utilisant la kétamine / xylazine par rapport à l&#39;isoflurane (MBL, données non publiées). Ces différences pourraient être attribuées à des agents pathogènes ou utilisé à des variations dans les procédures de laboratoire, mais surtout mettre en évidence la variabilité potentielle de cette technique. En outre, les poumons récoltés peu de temps après l&#39;instillation intranasale montrent qu&#39;un pourcentage relativement faible de l&#39;inoculum bactérien initial atteint le poumon (dans le cas de Y. pestis, seulement 10% ont été récupérés 1 heure après l&#39;instillation 7), ce qui suggère qu&#39;un grand nombre de bactéries pourraient être retenus dans le TRS (ou avalé dans le tractus gastro-intestinal). Dans certains modèles de maladies, ce dépôt important de bactéries sur la muqueuse de l&#39;URT peut confondre notre compréhension de la progression de la maladie si l&#39;organisme est capable de coloniser la cavité nasale murin d&#39;une manière incompatible avec la maladie humaine. Par exemple, en utilisant in vivo &lt;/ Em&gt; imagerie, il a été observé que pseudomallei, qui ne colonise pas l&#39;URT humaine, provoque une infection opportuniste écrasante de la cavité nasale de souris lors de la livraison par la méthode d&#39;instillation intranasale 8. D&#39;autres procédés pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris ont également été utilisés dans la recherche des maladies infectieuses. Cependant, par rapport à l&#39;instillation intranasale ces méthodes ont tendance à exiger plus de compétences techniques et / ou des équipements coûteux sans pour autant éliminer le risque d&#39;infection initiation à plusieurs sites (par exemple, aérosol [URT et TLR]; transorale [tube digestif et TLR]; et intra-trachéale chirurgicale [LRT et sang]). Compte tenu des complications potentielles qui pourraient être associés à des sites secondaires de l&#39;infection, nous avons cherché à développer une approche intra-trachéale qui contourne l&#39;URT et offre pathogène directement dans les poumons de souris anesthésiées, mais limite également inoculat involontaireions dans le sang ou du tube digestif. À cette fin, intratrachéale (GI-TI) instillation d&#39;intubation médiation a été conçu comme une procédure non chirurgicale qui garantit LRT instillation d&#39;inoculum en incluant une étape intermédiaire pour vérifier le placement de cathéter approprié avant l&#39;instillation. Cette méthode est décrite à l&#39;aide de colorant instillation de démontrer visuellement large répartition de l&#39;inoculum dans tout le poumon, et P. aeruginosa instillation de mettre en évidence la livraison très efficace (&gt; 98% de l&#39;inoculum) de cette méthode pour le poumon. Surtout, alors que développé à l&#39;origine pour la livraison bactérienne, IMIT propose également un outil efficace pour: i) l&#39;instillation de diverses molécules à l&#39;étude d&#39;autres modèles de maladies respiratoires, ii) la prestation thérapeutique spécifique du poumon, et iii) des études de la fonction pulmonaire de base, y compris ciblé délivrance d&#39;ARNi dans les poumons.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1035">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:447px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Rodent, Tilting WorkStand</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">000A3467</td>
			<td>Base should be detached when working in a BSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Operating Otoscope Head</td>
			<td style="width:160px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:119px;">21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Otoscope 3.5 V Li Battery</td>
			<td style="width:160px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:119px;">71900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:311px;">Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">200A3589S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Incisor Loops</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">210A3490A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Cotton fine tip applicator</td>
			<td style="width:160px;">Puritan</td>
			<td style="width:119px;">871-PC DBL&#160;</td>
			<td>Used for tongue retraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">I.V. Catheter, 20G</td>
			<td style="width:160px;">Exel Int</td>
			<td style="width:119px;">26741</td>
			<td>Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Gas tight syringe, 250ul</td>
			<td style="width:160px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">81120</td>
			<td>Used for delivery of liquid inoculum by IMIT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Blunt Needle, 22G</td>
			<td style="width:160px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">91022</td>
			<td>Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm)</td>
			<td style="width:160px;">TheFiberOpticStore.com</td>
			<td style="width:119px;">FOF .50</td>
			<td>Cut to 6&#34; length: used as guide wire for intubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Tuberculin syringe, 1ml</td>
			<td style="width:160px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td>Assemble with fiber optic wire as guide wire</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Brilliant Blue R (Coomassie)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Tygon tubing, 1/16&#34;</td>
			<td style="width:160px;">Saint Gobain</td>
			<td style="width:119px;">ALC00002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Male luer 1/16&#34; barb</td>
			<td style="width:160px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">45503-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Female luer 1/16&#34; barb</td>
			<td style="width:160px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">45500-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Lidocaine, USP</td>
			<td style="width:160px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">LI102</td>
			<td>pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Sample bag, 1oz</td>
			<td style="width:160px;">Whirl-Pak</td>
			<td style="width:119px;">B01067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">U-bottom 96 well plate, sterile</td>
			<td style="width:160px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">650161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intubation-mediated intratracheal (imit) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system

Études sur les maladies respiratoires impliquent généralement l&#39;utilisation de modèles murins que les systèmes de substitution. Cependant, il existe des différences physiologiques importantes entre la souris et l&#39;appareil respiratoire humain, en particulier dans leurs voies respiratoires supérieures (URT). Dans certains modèles, ces différences dans la cavité nasale de souris peuvent avoir un impact significatif sur la progression de la maladie et de la présentation dans les voies respiratoires inférieures (LRT) lors de l&#39;utilisation des techniques d&#39;instillation intranasale, limitant potentiellement l&#39;utilité du modèle de souris pour étudier ces maladies. Pour ces raisons, il serait avantageux de développer une technique d&#39;inculquer bactéries directement dans les poumons de souris pour étudier la maladie de TLR en l&#39;absence d&#39;implication de l&#39;URT. Nous avons appelé cette technique spécifique intratrachéale de livraison intubation médiation (GI-TI) instillation du poumon. Cette technique non invasive réduit au minimum le potentiel pour instillation dans la circulation sanguine, ce qui peut se produire au cours de trad plus invasivechirurgicales approches onal intratrachéales d&#39;infection, et limite la possibilité de livraison digestif accessoire de l&#39;appareil. IMIT est un processus en deux étapes dans lequel les souris sont d&#39;abord intubés, avec une étape intermédiaire pour assurer le placement correct du cathéter dans la trachée, suivis par l&#39;insertion d&#39;une aiguille émoussée dans le cathéter de médiation livraison directe de bactéries dans les poumons. Cette approche facilite une efficacité de livraison&gt; 98% dans les poumons avec une excellente distribution de réactif dans l&#39;ensemble du poumon. Ainsi, IMIT représente une nouvelle approche pour étudier les maladies de TLR et administration de produits thérapeutiques directement dans les poumons, l&#39;amélioration de la capacité d&#39;utiliser la souris comme substituts pour étudier les maladies respiratoires chez les humains. En outre, la précision et la reproductibilité de ce système de livraison rend également prête à des normes de pratique de laboratoire (BPL) bons, ainsi que la livraison d&#39;une large gamme de réactifs qui doivent être livrés à haute efficacité pour les poumons.

Pour visualiser la distribution de matériel instillé par la méthode de la GI-TI, 50 pi de 0,1% colorant bleu de Coomassie Brilliant a été instillé dans les poumons d&#39;une souris anesthésiée. La souris a été immédiatement euthanasié et les poumons ont été prélevés par autopsie stérile. La figure 1 montre que le colorant a été remis à tous les lobes du poumon. Pour déterminer la quantité de bactéries remis aux poumons par la méthode de la GI-TI, trois groupes de souris (n = 3) ont été instillées avec trois concentrations différentes de P. aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7, et 1,21 x 10 6 unités formant des colonies [CFU] par 50 pi). Immédiatement après l&#39;instillation IMIT, les souris ont été euthanasiées, les poumons retirés, et le nombre de bactéries ont été énumérés et comparés à des inoculums (figure 2). Livraison de l&#39;inoculum est très efficace par cette méthode, avec&gt; 98% de l&#39;inoculum récupéré à partir des poumons de instilléles animaux. En outre, IMIT instillation était hautement reproductible quelle que soit la concentration de l&#39;inoculum (R2 = 0,9951). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Figure 1: IMIT instillation distribue inoculum à travers les poumons Les poumons de souris instillées avec 50 ul de 0,1% de Coomassie colorant bleu Bleu de spectacle distribués dans tous les lobes.. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Figure 2:. IMIT instillation de bactéries dans les poumons des souris ont été instillées avec P. aeruginosa et le nombre de bactéries inculquées dans les poumons (log 10 UFC - récupéré) ont été comparées à l&#39;inoculum estimée (log 10 UFC - livré). Chaque cercle représente la CFU / poumon d&#39;une souris individuelle (n = 3 pour chaquedose bactérienne).

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Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

L&#39;intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l&#39;étude de la maladie respiratoire, ainsi qu&#39;un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

24.0K vues.  University of Louisville Medical School.  L'intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l'étude de la maladie respiratoire, ainsi qu'un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques. 

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A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Recherche

Médecine

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

Endometriosis is a common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this study was to demonstrate the use of a blue dye (methylene blue) to stain peritoneal surfaces during laparoscopy (L/S) to detect the loss of peritoneal integrity in patients with pelvic pain and suspected endometriosis. Forty women with CPP and 5 women without pain were evaluated in this pilot study. During L/S, concentrated dye was sprayed onto peritoneal surfaces, then aspirated and rinsed with Lactated Ringers solution. Areas of localized dye uptake were evaluated for the presence of visible endometriotic lesions. Areas of intense peritoneal staining were resected and some fixed in 2.5% buffered gluteraldehyde and examined by scanning (SEM) electron microscopy. Blue dye uptake was more common in women with endometriosis and chronic pelvic pain than controls (85% vs. 40%). Resection of the blue stained areas revealed endometriosis by SEM and loss of peritoneal cell-cell contact compared to normal, non-staining peritoneum. Affected peritoneum was associated with visible endometriotic implants in most but not all patients. Subjective pain relief was reported in 80% of subjects. Based on scanning electron microscopy, we conclude that endometrial cells extend well beyond visible implants of endometriosis and appear to disrupt the underlying mesothelium. Subtle lesions of endometriosis could therefore cause pelvic pain by disruption of peritoneal integrity, allowing menstrual or ovulatory blood and associated pain factors access to underlying sensory nerves. Complete resection of affected peritoneum may provide a better long-term treatment for endometriosis and CPP. This simple technique appears to improve detection of subtle or near invisible endometriosis in women with CPP and minimal visual findings at L/S and may serve to elevate diagnostic accuracy for endometriosis at laparoscopy.

Loss of peritoneal integrity provides a new paradigm to understand and treat chronic pelvic pain in women with mild forms of endometriosis and can be easily detected using intraoperative instillation of dye at the time of laparoscopy.

Détection peropératoire de l&#39;endométriose subtil: un nouveau paradigme pour la détection et le traitement de la douleur pelvienne associée à la perte de l&#39;intégrité péritonéale

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasive Intratrachéal intubation pour étudier la pathologie et la physiologie des souris poumon

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier l&#39;angiogenèse pulmonaire spécifique

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instillation et la fixation méthodes utiles en recherche sur le cancer du poumon de souris

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

Une méthode Multimodal Imaging- et basée Stimulation-de l&#39;évaluation de connectivité liés excitabilité cérébrale chez les patients atteints d&#39;épilepsie

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

Retroductal Submandibulaire Gland instillation et Localized Fractionnée Irradiation dans un modèle de rat de salivaire Hyposécrétion

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study these pulmonary diseases. Previous pleural effusion models paid more attention to biological factors rather than nanoparticles in the environment. Here, we introduce a model to make pleural effusion in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica, and a method of nanoparticle isolation in the pleural effusion. By intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica with concentrations of 3.125, 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL, the pleural effusion in rats presented on day 3, peaked at days 7-10 in 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL groups, then slowly decreased and disappeared on day 14. When the concentration of polyacrylate/nanosilica increased, the pleural effusion is produced more and faster. This pleural fluid was detected by ultrasound examination or CT chest scanning and confirmed by dissection of rats. Silica nanoparticles were observed in the rats' pleural effusion by transmission electron microscope. These results showed that the exposure to polyacrylate/nanosilica leads to the induction of pleural effusion, which was consistent with our previous report in humans. Additionally, this model is beneficial for the further study of nanotoxicology and the pleural effusion diseases.

Here, we present a protocol to construct a pleural effusion model in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica.

Un modèle d’un épanchement Pleural chez le rat par Instillation intratrachéale de Polyacrylate/nanosilice

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...