Les entités liant SUMO rendent in vivo l’isolation des protéines sumoylées endogènes. Ceci est assez difficile en raison de la présence de protéase active spécifique sumo et les faibles fractions de protéines SUMOylated in vivo. L’isolement du protéome SUMOylated en utilisant des entités liant SUMO est avantageux car il reporte une augmentation de l’affinité globale pour les substrats SUMO.
Cela est dû au fait que les SOUS-ENSEMBLEs sont communs dans les protéines qui composent des répétitions en tandem de SIMs reconnaissant ainsi spécifiquement les molécules SUMO sur les protéines modifiées. L’utilisation d’entités liant sumo pour l’isolement et la caractérisation du protéome SUMOylated dans le cancer du foie est une méthode rapide et sensible. Il fournit des informations passées sur le rôle plutôt inconnu de la voie SUMOylation dans le cancer du foie dans une approche thérapeutique potentielle.
Les entités liant sumo peuvent être utilisées pour isoler et caractériser le protéome SUMOylated dans d’autres tissus que le foie, à la fois à partir de spécimens humains et de modèles animaux, ainsi que dans plusieurs modèles cellulaires. Bien que cette technique soit facile à exécuter, il faut prendre soin de l’analyse de plusieurs échantillons du même type. cube refroidisseur aux différentes étapes impliquées.
Par conséquent, nous recommandons de niveler soigneusement les tubes avant de lancer cette expérience. La démonstration visuelle de l’utilisation d’entités liant sumo facilite la révolution de ce protocole en particulier en raison des difficultés de manipulation des bits et de la perte de matériel pendant le protocole. Les cellules humaines d’hépatome ont été précédemment préparées par des cellules de placage dans des plaques de P100 à une densité de 1,2 à 1,5 million de cellules par plat et les maintiennent dans les médias de croissance standard à 37 degrés Celsius.
Lorsqu’il est prêt à utiliser les cellules, aspirer le média à partir des plaques et les laver avec cinq millimètres de PBS stérile. Mettez la plaque sur la glace et ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse complétés selon les instructions manuscrites. Ensuite, utilisez un grattoir à cellules pour gratter doucement les cellules du fond de la plaque dans le milieu de la lyse.
Alternativement, récolter les cellules par trypsinisation et ajouter un millilitre de trypsine-EDTA à la plaque en s’assurant que les cellules sont couvertes. Mettez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour leur permettre de se détacher de la plaque, puis ajoutez deux millilitres de milieu de croissance préchauffé pour arrêter la trypsinisation. Centrifuger les cellules à 150 fois G pendant 10 minutes et aspirer le surnatant.
Lavez ensuite les cellules avec du PBS et de la centrifugeuse pendant encore 10 minutes. Aspirer le supernatant et ajouter 500 microlitres de tampon de lyse. Centrifugez les cellules de lyse à 15000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis transférez les supernatants dans un tube frais et jetez la pastille.
Lorsqu’ils sont prêts à utiliser les foies de souris récoltés, homogénéisez 75 milligrammes de fragments congelés frais ou cassés en un millilitre de tampon de lyse glacée. Exécutez l’homogénéiseur selon les instructions manuscrites. Après homogénéisation tissulaire, centrifuger les échantillons à 15000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Transférer le surnatant dans un tube frais et jeter la pastille. Préparer les perles de glutathion en ajoutant un millilitre d’eau déionisée à 70 milligrammes de perles et en les reconstituant pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après gonflement, laver les perles trois fois avec 10 millilitres d’eau déionisée ou PBS, centrifugant à 300 fois G pendant cinq minutes après chaque lavage.
Après les lavages, resuspendez les perles dans un millilitre de PBS pour obtenir une boue de 50 % pour chaque échantillon à 100 microgrammes de TPS-SUBEs ou contrôle de la TPS à 100 microlitres de boue de perles de glutathion et 500 microlitres de PBS. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures pendant la rotation, puis récupérer les perles par centrifugation à 300 fois G pendant cinq minutes et les résusquer dans PBS. Prenez 10% du lysate de cellule précédemment préparé et diluez-le dans un volume égal de tampon bouillant 3X.
Ajouter 450 microlitres du lysate clarifié à 100 microlitres du lisier de perles de glutathion. Incuber le lysate avec les perles à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures tout en tournant lentement. Après l’incubation, faire tourner les perles à 300 fois G pendant cinq minutes et recueillir le surnatant pour analyse.
Transférer 10% du volume total dans un tube séparé et ajouter un volume égal de tampon d’ébullition 3X. Lavez l’échantillon restant trois fois en ajoutant un millilitre de PBS glacé avec 05% de tween 20 et en le faisant tourner à 300 fois G et quatre degrés Celsius pendant une minute. Aspirez soigneusement le surnatant en s’assurant qu’il ne reste plus de liquide.
Ensuite, élitez l’échantillon avec 15 microlitres de tampon bouillant 3X et 15 microlitres de tampon de lyse. Exécutez une analyse de tache occidentale selon les directions manuscrites. Si vous effectuez la spectrométrie de masse, désaltez les peptides à l’aide de microcoumns C18 à pointe de stade et dépensez-les en acide formic de 0,1 % avant l’analyse.
Chargez les échantillons sur un système LC-MS et analysez-les en triplicate. Procéder à l’identification des protéines et au calcul de l’abondance à l’aide du logiciel associé. Effectuer une analyse statistique selon les directives manuscrites.
Ce protocole a été utilisé pour isoler les protéines SUMOylated chez les souris atteintes d’une carence en glycine N-méthyltransferase qui provoque le développement spontané du cancer du foie et de leurs compagnons de litière de type sauvage. Ponceau S coloration a été effectuée sur l’entrée, le flow-through, et bound fractions de l’analyse de retrait subes. L’analyse occidentale de tache de LKB1 capturée avec subes montre que les niveaux de SUMOylation de LKB1 sont augmentés dans les tumeurs de foie.
Des cellules humaines d’hépatome et des cellules épithéliales hépatiques non transformées ont été employées pour étudier la capacité du sumo-piège d’interagir avec les protéines naturellement SUMOylated. Tout d’abord, la coloration conventionnelle des protéines a été utilisée pour visualiser le matériel total capturé avec les SOUS-MARINS. Puis la spectrométrie de masse a prouvé que 742 protéines ont été enrichies dans l’échantillon de SUBEs de cellules d’hépatome et 577 ont été enrichies dans l’échantillon épithélial de cellules non transformées de cellules de foie.
Lors d’expériences avec des SOUS-ensembles, il est important de maintenir les cellules et les tissus sur la glace et d’ajouter des millilitres spécifiques au tampon de lyse afin de maintenir la pureté de SUMOylated. Après visualisation du protéome SUMOylated avec subes, nous pouvons trouver la caractérisation en utilisant l’analyse occidentale de tache ou mass-spectrometry. L’application des SUBE pour isoler et caractériser le protéome SUMOylated dans les tissus de cancer du foie et les cellules d’hépatome ouvre la voie à explorer le rôle des modifications post-translationnelles de SUMO dans le cancer du foie qui peuvent fournir un mécanisme thérapeutique potentiel.
