Cette technique est un moyen fiable de fournir tout contenu tel que des médicaments, des protéines ou des cellules à des endroits spécifiques dans les tissus ou les animaux. Vous pouvez suivre la livraison et régler la version du contenu pour s’adapter à l’expérience que vous désirez. Il peut être utilisé pour traiter de nombreuses maladies de la cicatrisation des plaies aux maladies oculaires et cardiaques.
Le principal avantage de cette méthode est la capacité d’offrir des cellules thérapeutiques utilisant des microcapsules alginate aux sites cibles sans provoquer de réactions immunitaires et de maintenir une livraison soutenue de thérapeutiques fraîches sécrétées pendant une plus longue période de temps. Commencez par la culture des cellules épithéliales rétiniennes selon les instructions manuscrites. Passer les cellules quand ils atteignent 70 à 80% confluent en utilisant des procédures standard de culture tissulaire.
Pour encapsuler les cellules, mélanger l’alginate de sodium avec l’eau déionisée pour une concentration finale de 2% de poids au volume et purifier le mélange par filtration avec un filtre stérile de seringue de 0,2 micromètre. Essayez de trypsiniser, centrifugeuse, et laver les cellules avec 10 millimolar HEPES tamponné solution saline. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et ajuster la concentration finale des cellules à un million par millilitre de solution alginate.
Chargez 300 aliquots microlitres de l’alginate et du mélange de cellules dans une seringue de trois millilitres et attachez-la à une pompe à seringues. Préparez un bain gélissant selon les instructions manuscrites et placez-le dans un bécher stérile de 50 millilitres sous la pointe de la seringue à une aiguille de sept millimètres jusqu’à la distance de pulvérisation du bain. Réglez la tension à huit kilovolts et le débit à 30 millimètres par heure pour produire des microcapsules d’une taille d’environ 150 micromètres.
Connectez le clip au sol noir au fil de cuivre qui est à mi-chemin immergé dans le bain de hongre et connectez le clip du fil d’anode rouge à l’aiguille. Il faut environ 30 minutes pour préparer les cellules encapsulées de chaque lot d’un millilitre de l’alginate et du mélange cellulaire. Une fois formés, lavez les microcapsules avec la solution de lavage deux fois et incubez-les avec 10%FBS complété dmem media dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5%CO2.
Après une incubation de 24 heures, préparer un échantillon de 500 microlitres de microcapsules pour les colorer en les lavant deux fois dans la solution de lavage. Utilisez un kit d’analyse LIVE/DEAD pour les tacher pour leur viabilité. Pour s’assurer que les microcapsules sont de taille appropriée, diluez-les dans des supports sans sérum.
Aspirez-les soigneusement avec une seringue Hamilton de 2,5 microlitres. Éjectez lentement un microlitre tombe sur une lame de microscope et déterminez l’intégrité des microcapsules à l’aide d’un microscope Brightfield droit. Dans une souris bien anesthésiée, appliquer un lubrifiant oculaire pour maintenir l’humidité des yeux et utiliser une aiguille de seringue biseauté de calibre 3/8 pouces pour établir une ponction initiale des yeux juste en dessous du limbe.
Assurez-vous d’approcher l’œil d’une direction nasale à un angle de 45 degrés en gardant la pointe biseauté vers le haut pour éviter la perforation de la lentille. Ensuite, assurez-vous que la pointe entière de l’aiguille est insérée dans l’œil pour la génération de trous de guidage, mais veillez à ne pas aller trop loin et percer la rétine temporelle. Une fois cela terminé, rétractez lentement l’aiguille.
Dans le micromanipulateur, placez une pointe émoussée de calibre 2,5 microlitres hamilton qui a été remplie de solution capsule et alignez l’aiguille avec le trou de guidage initial. Tenez la tête de l’animal dans une position stable et manœuvrez délibérément l’aiguille vers l’œil. Pour assurer une position correcte de l’aiguille dans le vitré, insérez la seringue jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille puisse être visualisée derrière la lentille.
Injectez ensuite la solution capsule lentement pendant 25 à 30 secondes. Et une fois terminée, rétractez graduellement la seringue à pointe émoussée afin de minimiser les blessures à l’œil. Si nécessaire, ajustez la taille de la capsule en ajustant la tension et le débit en fonction des directions manuscrites.
L’encapsulation des cellules dans l’alginate a été confirmée avec la formation image de Brightfield et un essai de LIVE/DEAD a démontré que 90% des cellules étaient viables après encapsulation. La viabilité à long terme des cellules a été assurée en dissolvant les capsules dans le citrate de sodium et le replacage. L’injection intravitreal a été exécutée sous l’inspection visuelle qui a permis la visualisation des capsules dans le vitreux.
Lorsque vous essayez cette procédure, n’utilisez pas PBS pour les étapes de lavage parce que PBS dissout les microcapsules alginate formés. Après son développement, notre laboratoire est utilisé comme un système d’accouchement pour traiter les formes d’insuffisance cardiaque et d’hypertension. Cette technique est considérée comme un outil prometteur pour le traitement futur de différentes maladies cardiovasculaires et neurologiques.
