この技術は、薬物、タンパク質、細胞などのコンテンツを組織や動物の特定の場所に配信する信頼できる方法です。配信を追跡し、目的の実験に合わせてコンテンツのリリースを調整できます。創傷治癒から眼疾患および心疾患まで多くの疾患を治療するために使用することができる。
この方法の主な利点は、免疫反応を引き起こすことなく、標的部位にアルギン酸マイクロカプセルを使用して治療細胞を送達し、より長い期間、新しい分泌された治療薬の持続的な送達を維持する能力である。原稿の指示に従って、レチナル上皮細胞を培養することから始めます。それらは標準的な組織培養手順を使用して70〜80%の合流に達したときに細胞を通過させる。
細胞をカプセル化するには、アルギン酸ナトリウムと脱イオン水を混合して2%重量の最終濃度で体積を計り、0.2マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターで濾過して混合物を精製します。トリプシン化、遠心分離、10ミリモルHEPES緩衝生理液で細胞を洗浄する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、最終的な細胞濃度をアルギン酸溶液1ミリリットル当たり100万に調整します。
アルギン酸と細胞混合物の300マイクロリットルのアリコートを3ミリリットルシリンジにロードし、シリンジポンプに取り付けます。原稿の指示に従ってゲル化浴を準備し、7ミリメートルの針で注射器の先端の下の無菌50ミリリットルビーカーに入れ、噴霧距離を浴びる。電圧を8キロボルト、流量を1時間あたり30ミリメートルに調整し、約150マイクロメートルのマイクロカプセルを製造します。
黒いグラウンド クリップを、ゲル化槽に中途半端に沈んだ銅線に接続し、赤いアノード ワイヤのクリップを針に接続します。アルギン酸と細胞混合物の各1ミリリットルバッチからカプセル化された細胞を調製するのに約30分かかります。形成されたら、マイクロカプセルを洗浄液で2回洗浄し、摂氏37度と5%CO2の加湿インキュベーターで10%FBS補充DMEM培地でインキュベートします。
24時間インキュベーションした後、マイクロカプセルの500マイクロリットルサンプルを洗浄液で2回洗浄して染色します。生存率のためにそれらを染色するためにLIVE / DEADアッセイキットを使用してください。マイクロカプセルのサイズを適切に調整するには、無血清培地で希釈します。
慎重に2.5マイクロリットルハミルトン注射器でそれらを吸引します。ゆっくりと顕微鏡スライドに1マイクロリットルの滴を排出し、直立したブライトフィールド顕微鏡を使用してマイクロカプセルの完全性を決定します。適切に麻酔をかけられるマウスでは、眼の潤滑剤を塗布して眼の水分を維持し、26ゲージ3/8インチのベベリングシリンジ針を使用して、手足のすぐ下に最初の目の穿刺を確立します。
レンズの穿光を避けるために、斜めの先端を上に保つ45度の角度で鼻方向から目に近づくことを確認してください。次に、針先全体がガイド穴の生成のために目に挿入されていることを確認しますが、遠くに移動しすぎないように注意し、経時的な経時的な残量を穿刺してください。これが完了したら、ゆっくりと針を引っ込みます。
マイクロマニピュレーター内に、カプセル溶液で満たされた27ゲージの鈍い先端2.5マイクロリットルハミルトン注射器を置き、最初のガイドホールで針を並べます。動物の頭を安定した位置に保持し、意図的に針を目に向かって操縦します。正しい針の位置を確認するために、針先がレンズの後ろに視覚化されるまで注射器を挿入します。
その後、カプセル溶液を25~30秒間ゆっくりと注入します。そして、完成したら、目の損傷を最小限に抑えるために、鈍い先端の注射器を徐々に引き込む。必要に応じて、原稿の方向に応じて電圧と流量を調整してカプセルサイズを調整します。
アルギン酸中の細胞のカプセル化はブライトフィールドイメージングで確認され、LIVE/DEADアッセイは細胞の90%が封入後に生存していることを示した。細胞の長期生存率は、カプセルをクエン酸ナトリウムに溶解し、再めっきすることによって保証された。ビトリア内注射は、膜内のカプセルの可視化を可能にする目視検査の下で行われた。
この手順を試みる場合、PBSが形成したアルギン酸マイクロカプセルを溶解するので、いかなる洗浄工程にもPBSを使用しないでください。その開発後、私たちの研究室は心不全や高血圧の形態を治療するためのデリバリーシステムとして使用されます。この技術は、異なる心血管疾患および神経疾患の将来の治療のための有望なツールと考えられています。
