Diese Technik ist eine zuverlässige Möglichkeit, Inhalte wie Medikamente, Proteine oder Zellen an bestimmte Orte in Geweben oder Tieren zu liefern. Sie können die Lieferung verfolgen und die Veröffentlichung des Inhalts so abstimmen, dass sie zu dem von Ihnen geplanten Experiment passt. Es kann verwendet werden, um zahlreiche Krankheiten von der Wundheilung bis hin zu Augen- und Herzerkrankungen zu behandeln.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, therapeutische Zellen mit Alginat-Mikrokapseln an die Zielstellen zu liefern, ohne Immunreaktionen zu verursachen und eine nachhaltige Lieferung von frischen abgesonderten Therapeutika für einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie mit der Kultivierung von Retinalen epithelzellen nach Manuskriptanweisungen. Durchkommen sie die Zellen, wenn sie 70 bis 80% Konfluenz erreichen, mit Standard-Gewebekulturverfahren.
Um die Zellen zu verkapseln, mischen Sie Natriumalginat mit entionisiertem Wasser für eine Endkonzentration von 2% Volumen zu Volumen und reinigen Sie das Gemisch durch Filtration mit einem 0,2 Mikrometer sterilen Spritzenfilter. Versuchen, zentrifugieren und waschen Sie die Zellen mit 10 Millimolar HEPES gepufferte Saline-Lösung. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen und die endgültige Zellkonzentration auf eine Million pro Milliliter Alginatlösung einzustellen.
300 Mikroliter Aliquots des Alginat- und Zellengemischs in eine Drei-Milliliter-Spritze geben und an einer Spritzenpumpe befestigen. Bereiten Sie ein Gelierbad nach Manuskriptanweisungen vor und legen Sie es in einem sterilen 50-Milliliter-Becher unter der Spritzenspitze an einer Sieben-Millimeter-Nadel, um den Sprühabstand zu besaugen. Stellen Sie die Spannung auf acht Kilovolt und die Durchflussrate auf 30 Millimeter pro Stunde ein, um Mikrokapseln zu erzeugen, die etwa 150 Mikrometer groß sind.
Schließen Sie den schwarzen Erdungsclip mit dem Kupferdraht an, der auf halbem Weg in das Gelierbad getaucht ist, und verbinden Sie den Clip des roten Anodendrahtes mit der Nadel. Es dauert etwa 30 Minuten, um gekapselte Zellen aus jeder Milliliter-Charge des Alginat- und Zellgemischs vorzubereiten. Wenn sie gebildet sind, waschen Sie die Mikrokapseln zweimal mit Waschlösung und inkubieren Sie sie mit 10%FBS ergänztdmEM Medien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2.
Nach einer 24-stündigen Inkubation eine 500-Mikroliter-Probe von Mikrokapseln zur Färbung vorbereiten, indem Sie sie zweimal in Waschlösung waschen. Verwenden Sie ein LIVE/DEAD Assay-Kit, um sie für die Lebensfähigkeit zu beflecken. Um sicherzustellen, dass die Mikrokapseln entsprechend dimensioniert sind, verdünnen Sie sie in serumfreien Medien.
Saugen Sie sie vorsichtig mit einer 2,5 Mikroliter Hamilton Spritze. Werfen Sie langsam einen Mikroliter tropfen auf ein Mikroskop-Dia und bestimmen Sie die Integrität der Mikrokapseln mit einem aufrechten Brightfield Mikroskop. Wenden Sie bei einer entsprechend anästhesierten Maus Augenschmiermittel auf, um die Feuchtigkeit des Auges aufrechtzuerhalten, und verwenden Sie eine 26 Gauge 3/8 Zoll abgeschrägte Spritzennadel, um eine anfängliche Augenpunktion direkt unter dem Limbus zu etablieren.
Achten Sie darauf, sich dem Auge aus nasaler Richtung in einem 45-Grad-Winkel zu nähern und die abgeschrägte Spitze nach oben zu halten, um eine Perforation der Linse zu vermeiden. Als nächstes stellen Sie sicher, dass die gesamte Nadelspitze in das Auge für die Führung LochErzeugung eingeführt wird, aber achten Sie darauf, nicht zu weit zu reisen und die zeitliche Netzhaut zu durchstechen. Sobald dies abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel langsam zurück.
Platzieren Sie innerhalb des Mikromanipulators eine 27 Gauge stumpfe Spitze 2,5 Mikroliter Hamilton Spritze, die mit Kapsellösung gefüllt wurde, und säumen Sie die Nadel mit dem ersten Führungsloch. Halten Sie den Kopf des Tieres in einer stabilen Position und manövrieren Sie die Nadel absichtlich in Richtung des Auges. Um eine korrekte Nadelposition innerhalb des Glaskörpers zu gewährleisten, legen Sie die Spritze ein, bis die Nadelspitze hinter der Linse visualisiert werden kann.
Dann injizieren Sie die Kapsellösung langsam im Laufe von 25 bis 30 Sekunden. Und nach Fertigstellung, nach und nach ziehen Sie die stumpfe Spitzenspritze, um Verletzungen des Auges zu minimieren. Passen Sie bei Bedarf die Kapselgröße an, indem Sie die Spannung und die Durchflussrate entsprechend den Manuskriptrichtungen anpassen.
Die Verkapselung der Zellen in Alginat wurde mit Brightfield-Bildgebung bestätigt und ein LIVE/DEAD-Test zeigte, dass 90% der Zellen nach der Verkapselung lebensfähig waren. Die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch das Auflösen der Kapseln in Natriumcitrat und Replating sichergestellt. Die intravitreale Injektion wurde im Rahmen einer visuellen Inspektion durchgeführt, die die Visualisierung von Kapseln im Glaskörper ermöglichte.
Verwenden Sie beim Versuch dieses Verfahrens PBS nicht für Waschschritte, da PBS gebildete Alginat-Mikrokapseln auflöst. Nach seiner Entwicklung wird unser Labor als Abgabesystem zur Behandlung von Formen von Herzinsuffizienz und Bluthochdruck eingesetzt. Diese Technik gilt als vielversprechendes Werkzeug für die zukünftige Behandlung verschiedener herz-kreislauf- und neurologischer Erkrankungen.
