이 기술은 약물, 단백질 또는 세포와 같은 모든 콘텐츠를 조직이나 동물의 특정 위치에 전달하는 신뢰할 수있는 방법입니다. 당신은 배달을 추적하고 당신이 원하는 실험에 맞게 내용의 릴리스를 조정할 수 있습니다. 상처 치유에서 안구 및 심장 질환에 이르기까지 수많은 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
이 방법의 주요 장점은 면역 반응을 일으키지 않고 표적 부위에 알기네이트 마이크로 캡슐을 사용하여 치료 세포를 전달하고 장기간 신선한 분비 치료법의 지속적인 전달을 유지하는 능력입니다. 원고 의 지시에 따라 망막 상피 세포를 배양하여 시작합니다. 표준 조직 배양 절차를 사용하여 70~80%의 합류에 도달하면 세포를 통과시합니다.
세포를 캡슐화하기 위해, 알기네이트 나트륨을 1제수와 혼합하여 2%의 최종 농도를 부피에 넣고 0.2 마이크로미터 멸균 주사기 필터로 여과를 통해 혼합물을 정화한다. 트립시네이드, 원심분리기, 10밀리머 HEPES 완충식식염으로 세포를 세척한다. 혈류계를 사용하여 세포를 계산하고 최종 세포 농도를 alginate 용액의 1 밀리리터당 백만으로 조정합니다.
알기네이트와 세포 혼합물의 300 마이크로리터 알리쿼트를 3밀리리터 주사기에 적재하고 주사기 펌프에 부착합니다. 원고 의 방향에 따라 젤링 목욕을 준비하고 7 밀리미터 바늘의 주사기 팁 아래에 멸균 된 50 밀리리터 비커에 넣어 목욕 스프레이 거리. 전압을 8킬로볼트로 조정하고 유속량을 시간당 30밀리미터로 조정하여 약 150마이크로미터 크기의 마이크로캡슐을 생성합니다.
검은 색 접지 클립을 겔링 욕조에 반쯤 잠긴 구리 와이어에 연결하고 빨간색 양극 와이어클립을 바늘에 연결합니다. 알기네이트및 세포 혼합물의 각 밀리리터 배치에서 캡슐화된 세포를 준비하는 데 약 30분이 걸립니다. 형성되면, 세척 용액으로 마이크로 캡슐을 두 번 세척하고 10 % FBS가 37섭씨 37도 및 5 %의 CO2에서 가습 인큐베이터에서 DMEM 미디어를 보충하여 배양하십시오.
24 시간 인큐베이션 후, 세척 용액에 두 번 세척하여 염색을위한 마이크로 캡슐의 500 마이크로 리터 샘플을 준비합니다. 라이브/데드 분석 키트를 사용하여 생존가능성을 위해 염색하십시오. 마이크로 캡슐의 크기가 적절하게 크기가 되도록 혈청이 없는 매체에서 희석하십시오.
2.5 마이크로리터 해밀턴 주사기로 조심스럽게 흡인합니다. 마이크로리터 1개를 현미경 슬라이드에 천천히 배출하고 수직 브라이트필드 현미경을 사용하여 마이크로캡슐의 무결성을 결정합니다. 적절하게 마취된 마우스에서 안구 윤활유를 바르면 안구 용액을 유지하고 26 게이지 3/8 인치 베브링 주사기 바늘을 사용하여 림푸스 바로 아래에 초기 눈 구멍을 확립하십시오.
렌즈 천포를 피하기 위해 45도 각도로 비강 방향에서 눈에 접근해야 합니다. 다음으로, 전체 바늘 팁이 안내구멍 생성을 위해 눈에 삽입되어 있는지 확인하지만 너무 멀리 여행하지 말고 측두망망에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 이 작업이 완료되면 천천히 바늘을 철회하십시오.
마이크로 조작기 내에서 캡슐 용액으로 채워진 27 게이지 무딘 팁 2.5 마이크로 리터 해밀턴 주사기를 배치하고 바늘을 초기 가이드 구멍으로 정렬하십시오. 동물의 머리를 안정된 자세로 잡고 의도적으로 바늘을 눈으로 움직입니다. 유리체 내에서 올바른 바늘 위치를 보장하기 위해, 바늘 끝이 렌즈 뒤에 시각화 될 때까지 주사기를 삽입.
그런 다음 25~30초 동안 캡슐 용액을 천천히 주입합니다. 그리고 완료되면, 점차 눈에 부상을 최소화하기 위해 무딘 팁 주사기를 철회. 필요한 경우 원고 방향에 따라 전압및 유량을 조정하여 캡슐 크기를 조정합니다.
알지네이트에 있는 세포의 캡슐화는 브라이트필드 화상 진찰및 LIVE/DEAD 분석으로 확인되었습니다 세포의 90%가 가능한 포스트 캡슐화이었다는 것을 보여주었습니다. 세포의 장기 생존가능성은 구연산 나트륨에 있는 캡슐을 용해하고 투약함으로써 보장되었다. 인트라비탈 주사는 유리체에서 캡슐의 시각화를 허용하는 육안으로 수행되었다.
이 절차를 시도할 때 PBS는 형성된 알기네이트 마이크로 캡슐을 용해하기 때문에 PBS를 세척 단계에 사용하지 마십시오. 개발 후, 우리의 실험실은 심부전과 고혈압의 형태를 취급하기 위하여 전달 시스템으로 이용됩니다. 이 기술은 다른 심장 혈관 및 신경 질환의 미래 치료를위한 유망한 도구로 간주됩니다.
