Bu teknik, ilaçlar, proteinler veya hücreler gibi içerikleri dokularda veya hayvanlardaki belirli yerlere sunmanın güvenilir bir yoludur. Teslimatı izleyebilir ve istediğiniz deneye uyacak şekilde içeriğin serbest bırakılmasını ayarlayabilirsiniz. Yara iyileşmesinden oküler ve kalp hastalıklarına kadar birçok hastalığın tedavisinde kullanılabilir.
Bu yöntemin en büyük avantajı, herhangi bir bağışıklık reaksiyonuna neden olmadan hedef bölgelere aljinat mikrokapsüller kullanarak terapötik hücreler sunabilmek ve daha uzun bir süre için taze salgılanan terapötik sürekli bir teslimat korumaktır. El yazması yönlere göre retinal epitel hücrelerini bireleyerek başlayın. Standart doku kültürü prosedürlerini kullanarak hücreleri %70-80'e ulaştıklarında geçiş.
Hücreleri kapsüllemek için sodyum aljinat %2'lik son konsantrasyoniçin deiyonize su ile karıştırın ve 0,2 mikrometre steril şırınga filtresi ile filtrasyon yoluyla karışımı arındırın. Trypnize, santrifüj, ve 10 milimolar HEPES tamponlu tuzlu çözelti ile hücreleri yıkayın. Hücreleri saymak ve aljinat çözeltisi bir mililitre başına bir milyon son hücre konsantrasyonu ayarlamak için bir hemositometre kullanın.
Üç mililitreşyon şırınga içine aljinat ve hücre karışımı 300 mikrolitre aliquots yükleyin ve bir şırınga pompası ekleyin. El yazması talimatlara göre bir jelleme banyosu hazırlayın ve banyo püskürtme mesafesi banyo yedi milimetrelik bir iğne de şırınga ucu altında steril 50 mililitrelik bir kabın içinde yerleştirin. Yaklaşık 150 mikrometre büyüklüğünde mikrokapsül üretmek için voltajı sekiz kilovolta ve akış hızını saatte 30 milimetreye ayarlayın.
Siyah zemin tonasını, jellebanyosuna yarı yarıya batırılmış bakır kabloya bağlayın ve kırmızı anodu telinin klibini iğneye bağlayın. Bu aljinat ve hücre karışımı her bir mililitre toplu kapsüllü hücreleri hazırlamak için yaklaşık 30 dakika sürer. Oluşturulduğunda, mikrokapsülleri iki kez yıkama solüsyonu ile yıkayın ve 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuvözde %10 FBS destekli DMEM media ile kuluçkaya yatırın.
24 saatlik kuluçkadan sonra, 500 mikrolitrelik mikrokapsül örneğini yıkama çözeltisinde iki kez yıkayarak boyama için hazırlayın. Canlılık için onları lekelemek için bir LIVE / DEAD tsay kiti kullanın. Mikrokapsüllerin uygun şekilde boyutlandırıldığından emin olmak için serumsuz ortamda seyreltin.
Dikkatle 2.5 mikrolitre Hamilton şırınga ile onları aspire. Yavaşça bir mikrolitre bir mikroskop slayt üzerine düşer ve dik brightfield mikroskop kullanarak mikrokapsülbütünlüğünü belirlemek. Uygun bir anestezili farede, göz nemini korumak için oküler yağlayıcı uygulayın ve limbusun hemen altında bir ilk göz delinmesi oluşturmak için 26 gauge 3/8 inç yontma şırınga iğnesi kullanın.
Lens inmesini önlemek için burun ucunu yukarı doğru tutarak 45 derecelik bir açıyla göze yaklaştırın. Daha sonra, tüm iğne ucu kılavuz delik üretimi için göze takılı olduğundan emin olun, ama çok uzak seyahat ve temporal retina delinme meye dikkat edin. Bu tamamlandığında, yavaşça iğneyi geri çek.
Mikromanipülatörün içine, kapsül solüsyonuyla doldurulmuş 27 kalibrelik künt ucu 2.5 mikrolitre Hamilton şırıngası yerleştirin ve iğneyi ilk kılavuz deliğiyle hizalayın. Hayvanın başını sabit bir pozisyonda tutun ve iğneyi göze doğru kasıtlı olarak hareket ettirin. Vitreus içinde doğru bir iğne pozisyonu sağlamak için, iğne ucu merceğin arkasında görselleştirilene kadar şırıngayı takın.
Daha sonra kapsül çözeltisini 25-30 saniye boyunca yavaşça enjekte edin. Ve tamamlandıktan sonra, yavaş yavaş göz yaralanmasını en aza indirmek için künt ucu şırınga geri çekin. Gerekirse, gerilim ve akış hızını el yazması yönlere göre ayarlayarak kapsül boyutunu ayarlayın.
Aljinitteki hücrelerin kapsülasyonu Brightfield görüntüleme ile doğrulandı ve LIVE/DEAD sedası hücrelerin %90'ının kapsülleme sonrası canlı olduğunu gösterdi. Hücrelerin uzun süreli canlılığı sodyum sitrat ve rekaplama kapsülleri çözülerek sağlanmıştır. İntravitreal enjeksiyon vitreus kapsülgörselleştirilmesi için izin görsel muayene altında yapıldı.
Bu prosedürü denerken, PBS oluşan aljinit mikrokapsülleri eritterken herhangi bir yıkama adımı için PBS kullanmayın. Gelişiminden sonra, bizim laboratuvar kalp yetmezliği ve hipertansiyon formları tedavi etmek için bir dağıtım sistemi olarak kullanılır. Bu teknik, farklı kardiyovasküler ve nörolojik hastalıkların gelecekteki tedavisi için umut verici bir araç olarak kabul edilir.
