Esta técnica é uma maneira confiável de fornecer qualquer conteúdo, como drogas, proteínas ou células para locais específicos em tecidos ou animais. Você pode acompanhar a entrega e ajustar a liberação do conteúdo para se adequar ao experimento desejado. Pode ser usado para tratar inúmeras doenças, desde a cicatrização de feridas até doenças oculares e cardíacas.
A principal vantagem deste método é a capacidade de fornecer células terapêuticas usando microcápsulas alginatos para os locais alvo sem causar reações imunológicas e manter uma entrega sustentada de terapêuticas secretas frescas por um período maior de tempo. Comece por culminar células epiteliais da retina de acordo com as instruções do manuscrito. Passagem das células quando atingem 70 a 80% de confluência usando procedimentos padrão de cultura tecidual.
Para encapsular as células, misture alginato de sódio com água deionizada para uma concentração final de 2% de peso ao volume e purifique a mistura via filtração com um filtro de seringa estéril de 0,2 micrômetro. Trypsinize, centrífuga e lave as células com solução salina tamponada HEPES de 10 mililitros. Use um hemótmetro para contar as células e ajustar a concentração celular final para um milhão por mililitro de solução de alginato.
Carregue 300 alíquotas de microliter da mistura de alginato e células em uma seringa de três mililitros e anexe-a a uma bomba de seringa. Prepare um banho de gelagem de acordo com as instruções do manuscrito e coloque-o em um béquer estéril de 50 mililitros abaixo da ponta da seringa em uma agulha de sete milímetros para a distância de pulverização do banho. Ajuste a tensão para oito quilovolts e a vazão para 30 milímetros por hora para produzir microcápsulas de cerca de 150 micrômetros de tamanho.
Conecte o clipe de terra preto ao fio de cobre que está meio submerso no banho de gelagem e conecte o clipe do fio ânodo vermelho à agulha. Leva aproximadamente 30 minutos para preparar células encapsuladas de cada um lote mililitro da mistura de alginato e celular. Quando formado, lave as microcápsulas com solução de lavagem duas vezes e incuba-as com mídia DMEM suplementada de 10%FBS em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%DE CO2.
Após uma incubação de 24 horas, prepare uma amostra de 500 microliter de microcápsulas para coloração, lavando-as duas vezes em solução de lavagem. Use um kit de ensaio LIVE/DEAD para manchá-los para viabilidade. Para garantir que as microcápsulas sejam adequadamente dimensionadas, dilui-as em mídia livre de soro.
Aspire-os cuidadosamente com uma seringa Hamilton de 2,5 microliter. Ejete lentamente um microliter em um slide de microscópio e determine a integridade das microcápsulas usando um microscópio Brightfield vertical. Em um rato apropriadamente anestesiado, aplique lubrificante ocular para manter a umidade dos olhos e use uma agulha de seringa chanfrada de 3/8 polegadas de calibre 26 para estabelecer uma punção inicial do olho logo abaixo do limbus.
Certifique-se de se aproximar do olho a partir de uma direção nasal em um ângulo de 45 graus mantendo a ponta chanfrada para cima para evitar perfuração da lente. Em seguida, certifique-se de que toda a ponta da agulha está inserida no olho para a geração de orifícios guia, mas tome cuidado para não viajar muito longe e perfurar a retina temporal. Uma vez que isso esteja completo, retraia lentamente a agulha.
Dentro do micromanipulador, coloque uma seringa Hamilton de calibre 27 de bitola 2,5 microliter que foi preenchida com solução de cápsula e forra a agulha com o orifício guia inicial. Segure a cabeça do animal em uma posição estável e deliberadamente manobrem a agulha em direção ao olho. Para garantir uma posição correta da agulha dentro do vítreo, insira a seringa até que a ponta da agulha possa ser visualizada atrás da lente.
Em seguida, injete a solução da cápsula lentamente ao longo de 25 a 30 segundos. E uma vez concluída, retraia gradualmente a seringa de ponta cega, a fim de minimizar a lesão no olho. Se necessário, ajuste o tamanho da cápsula ajustando a tensão e a taxa de fluxo de acordo com as instruções do manuscrito.
O encapsulamento das células em alginato foi confirmado com imagens brightfield e um ensaio LIVE/DEAD demonstrou que 90% das células eram viáveis pós-encapsulamento. A viabilidade a longo prazo das células foi garantida pela dissolução das cápsulas em citrato de sódio e replação. A injeção intravitreal foi realizada sob inspeção visual que permitiu a visualização de cápsulas no vítreo.
Ao tentar este procedimento, não use PBS para quaisquer etapas de lavagem porque o PBS dissolve microcápsulas alginato formadas. Após seu desenvolvimento, nosso laboratório é usado como um sistema de parto para tratar formas de insuficiência cardíaca e hipertensão. Esta técnica é considerada uma ferramenta promissora para o tratamento futuro de diferentes doenças cardiovasculares e neurológicas.
